NLRP3炎癥小體介導單核細胞增生李斯特菌感染小鼠和巨噬細胞的細胞焦亡

袁琳， 朱昱蓉， 林琳， 黃霜， 姜旭淦， 陳盛霞

(江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013)

單核細胞增生李斯特菌(Listeriamonocytogenes，Lm)是一種重要的人獸共患食源性病原，被WHO列為四大食源性病原菌之一。免疫力低下的人群(如老人、嬰幼兒、孕婦等)，Lm感染會造成致命的腦膜炎、敗血癥，孕婦早產、流產、死胎等[1]，死亡率可高達20%～30%，危害很大，已成為一種全球性疾病。

研究發現，炎癥小體和細胞焦亡與多種感染性疾病、神經系統疾病、代謝性疾病以及心血管疾病等密切相關[2]。細胞焦亡是細胞程序性死亡機制中的一種特殊方式，主要通過炎癥小體介導包含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶1(caspase-1)在內的多種caspase的激活，造成包括消化道皮膚素D(gasdermin D，GSDMD)在內的多種gasdermin家族成員發生剪切和多聚化，表現為GSDMD前體蛋白(pro-GSDMD)剪切，釋放氨基端裂解片段(GSDMD-NT)，造成細胞穿孔，進而引起細胞死亡。相比于細胞凋亡，細胞焦亡發生得更快，并會伴隨著大量促炎癥因子的釋放。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體是目前研究較為透徹的炎癥小體之一，由NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和caspase-1三部分組成，可以被多種微生物、內源性危險信號和環境刺激物激活[3]。MCC950是針對NLRP3炎癥小體的特異性抑制劑，主要通過改變NLRP3的構象來抑制炎癥小體的形成[4]。目前，炎癥小體對Lm感染引起的免疫調控機制仍不清晰。本研究通過體內和體外實驗，檢測Lm感染C57B/6小鼠和人急性單核細胞白血病細胞系(human acute monocytic leukemia cell line，THP-1)源巨噬細胞的細胞焦亡及相關炎癥小體的表達水平，并通過NLRP3炎癥小體抑制劑MCC950來探討NLRP3炎癥小體在Lm感染過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、細胞與實驗動物 單核細胞增生李斯特菌EDG株由天津醫科大學申艷娜教授惠贈，THP-1細胞購于中科院上海細胞庫，5～6周齡雌性C57B/6小鼠購于江蘇大學動物實驗中心。

1.1.2 主要試劑 RPMI 1640培養基及胎牛血清(以色列BI公司)；腦心浸出液肉湯(BHI，北京路橋技術股份有限公司)；實時熒光定量PCR(qRT-PCR)所用引物由上海生工合成；Trizol試劑、逆轉錄試劑(南京諾唯贊公司)；LPS、ATP(美國Sigma公司)；人IL-1β ELISA 試劑盒(杭州聯科生物公司)；NLRP3 抗體(美國Abcam公司)；ASC抗體(美國Santa Cruz公司)；caspase-1前體蛋白(pro-caspase-1)、IL-β前體蛋白(pro-IL-β)、caspase-1裂解片段蛋白20(caspase-1 p20)和IL-1β裂解片段蛋白17(IL-1β-17)抗體(沈陽萬類公司)，GSDMD抗體(美國CST公司)；HRP標記的羊抗兔和羊抗小鼠二抗(北京康為世紀公司)；Alexa Fluor488羊抗小鼠熒光二抗(南京福麥斯公司)；CoraLite594羊抗兔熒光二抗(武漢Proteintech公司)；MCC950(美國MCE公司)。

1.1.3 主要儀器 二氧化碳細胞培養箱、紫外分光光度計(美國Thermo Fisher公司)；PCR儀(上海天能公司)；qRT-PCR StepOne Plus(美國ABI公司)；電泳儀(美國Bio Rad公司)；熒光顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 Lm培養 挑取Lm單個菌落接種于BHI培養基中，37 ℃ 200 r/min于恒溫空氣浴搖床培養16 h，在無菌條件下離心去除BHI培養液，并用PBS清洗2次，使用分光光度計調整細菌懸液光密度至D(600 nm)=1，此時對應細菌濃度約為1×109CFU/mL，用于后續實驗。

1.2.2 Lm感染C57B/6小鼠及組織蛋白提取 C57B/6小鼠隨機分為Lm感染組(Lm組)和陰性對照組(NC組)，每組3只，分別經尾靜脈注射等體積Lm菌液(5×104CFU/只)及無菌PBS，24 h后斷頸處死，收集小鼠脾臟、肝臟和腦組織，用組織蛋白提取試劑盒提取蛋白。

1.2.3 THP-1細胞培養及THP-1源巨噬細胞誘導 THP-1細胞用含10%胎牛血清RPMI 1640培養基在5% CO2，37 ℃恒溫培養箱中常規培養，細胞密度達到約90%時，1 ∶3進行傳代。取6代以內狀態良好的細胞，用佛波酯(100 ng/mL)誘導THP-1細胞分化為巨噬細胞，誘導時間為48 h。

1.2.4 Lm感染THP-1源巨噬細胞 體外實驗包括Lm組、NC組、LPS+ATP組(陽性對照組)、Lm+MCC950組(感染+抑制劑組)和LPS+ATP+MCC950組(陽性對照+抑制劑組)。用6孔或24孔板培養細胞，每孔加入1×106個或2×105個THP-1源巨噬細胞。Lm組按感染復數(multiplicity of infection，MOI)=10接種Lm于細胞中，孵育1 h后加入10 μL慶大霉素殺胞外菌，殺菌1 h后換無抗生素培養基繼續培養。NC組加等體積PBS。LPS+ATP組先加100 ng/mL LPS，3 h后再加5 mmol/L ATP孵育30 min，吸棄培養基加入新培養基繼續培養。Lm+MCC950組和LPS+ATP+MCC950組均先加40 μmol/L MCC950抑制劑于細胞中，2 h后分別進行細菌刺激或陽性對照刺激。從加入Lm開始記為0 h，于6 h和24 h收集細胞培養上清用于ELISA檢測；0 h、1 h、3 h和6 h收集細胞用于qRT-PCR檢測，3 h收集細胞用于蛋白質印跡法及免疫熒光檢測。

1.2.5 qRT-PCR檢測細胞NLRP3、ASC、caspase-1、IL-1β、IL-18的mRNA表達 加入Trizol試劑裂解細胞，按照說明書提取總RNA，逆轉錄后采用SYBR Green Ⅰ染料法進行定量PCR。引物序列如下，內參GAPDH：上游5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGAT-3′，下游5′- CTGGAAGATGGTGATGGGATT-3′，擴增產物169 bp。NLRP3：上游5′-GCTGCGATCAACAGGCGAGAC-3′，下游5′-AAGGCTGTCCTCCTGGCATACC-3′，擴增產物108 bp。ASC：上游5′-CTCAAGAAGTTCAAGCTGAAGC-3′，下游5′-TAGGTCTCCAGGTAGAAGCTG-3′，擴增產物134 bp。Caspase-1：上游5′-GAAGAAACACTCTGAGCAAGTC-3′，下游5′-GATGATGATCACCTTCGGTTTG-3′，擴增產物112 bp。IL-1β：上游5′-ACAGTGGCAATGAGGATGAC-3′，下游5′-AGGTGCATCGTGCACATAAG-3′，擴增產物311 bp。IL-18：上游5′-ACAGTGGCAATGAGGATGAC-3′，下游：5′-AGGTGCATCGTGCACATAAG-3′，擴增產物121 bp。反應條件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，共40個循環。分析基因擴增的平均Ct值，以GAPDH為內參，按照公式2-ΔΔCt進行相對定量計算。

1.2.6 ELISA檢測細胞上清液中IL-1β含量 收集處理后的THP-1源巨噬細胞上清液，按照說明書進行操作，繪制標準曲線并計算出標本濃度。

1.2.7 蛋白質印跡法檢測小鼠和細胞炎癥小體及焦亡蛋白表達 試劑盒提取小鼠組織蛋白，常規方法提取細胞總蛋白，甲醇-氯仿濃縮細胞上清蛋白，各樣本蛋白濃度調整一致后，進行SDS-PAGE約2 h，然后350 mA、90 min將蛋白轉移至PVDF膜，用含5%脫脂牛奶的TBST室溫封閉2 h，一抗(GAPDH 1 ∶2 000，NLRP3 1 ∶1 000，ASC 1 ∶100，pro-IL-β 1 ∶1 000，pro-caspase-1 1 ∶500，IL-1β-17 1 ∶300，caspase-1 p20 1 ∶500，GSDMD 1 ∶1 000)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜，用相應HRP標記二抗(羊抗小鼠1 ∶3 000，羊抗兔1 ∶2 000)室溫孵育1 h，TBST洗膜，ECL曝光液曝光，拍照記錄結果。Image J軟件進行蛋白灰度掃描分析。

1.2.8 免疫熒光檢測ASC斑點及與NLRP3的共定位 24孔板內放置細胞玻片，每孔2×105個細胞，按MOI=10接種Lm 3 h后，加4%多聚甲醛室溫固定20 min，0.5% Triton X-100 4 ℃下透膜5 min后，用含5% BSA的PBS室溫封閉1 h，一抗(NLRP3 1 ∶100，ASC 1 ∶50)4 ℃孵育過夜，二抗(羊抗小鼠1 ∶250，羊抗兔1 ∶250)37 ℃孵育1 h。DAPI 1 ∶300稀釋，染核5 min，熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 Lm感染C57B/6小鼠和THP-1源巨噬細胞均發生焦亡

蛋白質印跡結果顯示，與NC組比較，Lm組小鼠脾、肝、腦組織以及THP-1細胞GSDMD蛋白表達水平均明顯增高(P<0.05)，且出現GSDMD-NT，見圖1。

*：P<0.05，與NC組比較

2.2 Lm感染C57B/6小鼠激活靶器官NLRP3炎癥小體

蛋白質印跡結果顯示，與NC組比較，Lm組小鼠脾、肝、腦組織NLRP3炎癥小體相關蛋白NLRP3、pro-caspase-1、pro-IL-1β及裂解片段caspase-1 p20、IL-1β-17蛋白表達量均明顯升高(P<0.05)，見圖2。

①：NLRP3蛋白；②：pro-caspase-1蛋白；③：caspase-1 p20蛋白；④：pro-IL-1β蛋白；⑤：IL-1β-17蛋白；*：P<0.05，與NC組比較

2.3 Lm感染THP-1源巨噬細胞激活NLRP3炎癥小體

qRT-PCR結果顯示，Lm感染1 h、3 h、6 h后NLRP3、caspase-1、IL-1β、IL-18mRNA表達量均較0 h呈上升趨勢(P<0.05)，且3 h升高最明顯，而ASCmRNA表達量變化不明顯，見圖3。收集6 h和24 h培養上清液，ELISA檢測結果顯示，Lm感染組及陽性對照組6 h和24 h IL-1β表達水平均升高(P<0.05)，見圖4。

*：P<0.05，與0 h比較

*：P<0.05，與NC組比較

蛋白質印跡結果顯示，Lm感染組及陽性對照組細胞裂解液中NLRP3、pro-caspase-1、pro-IL-1β蛋白表達量較陰性對照組明顯升高(P<0.05)；ASC略微升高，但差異無統計學意義；細胞上清液中出現pro-caspase-1及pro-IL-1β的活化裂解片段caspase-1 p20及IL-1β-17，見圖5。免疫熒光染色結果顯示，Lm感染后有明顯的ASC斑點形成，細胞中有炎癥小體的激活，同時ASC蛋白與NLRP3蛋白存在共定位，表明激活的是NLRP3炎癥小體。Lm組結果與LPS+ATP組一致，見圖6。

①：NLRP3蛋白；②：ASC蛋白；③：pro-caspase-1蛋白；④：pro-IL-1β蛋白；⑤：caspase-1 p20蛋白；⑥：IL-1β-17蛋白；

2.4 MCC950抑制劑處理后細胞焦亡減少

特異性抑制劑MCC950處理后，蛋白質印跡結果顯示，與Lm組比較，Lm+MCC950組裂解片段GSDMD-NT明顯減少(P<0.05)，總片段pro-GSDMD基本不變；與LPS+ATP組比較，LPS+ATP+MCC950組GSDMD-NT明顯也減少(P<0.05)，pro-GSDMD基本不變，見圖7。

DAPI(藍)染細胞核，FITC(綠)染ASC，TRITC(紅)染

①：NC組；②：Lm組；③：LPS+ATP組；④：Lm+MCC950組；⑤：LPS+ATP+MCC950組；a：P<0.05，與Lm組比較；b：P<0.05，與LPS+ATP組比較

3 討論

細胞焦亡可通過誘導宿主細胞死亡，將細菌從細胞內的復制生態位中驅逐出去[5-6]，或通過直接的抗菌作用來減少細胞內的細菌數量，是細胞內細菌清除的有效機制[2]。這一過程調節宿主對病原體的防御，但另一方面，過度的炎癥小體激活及細胞焦亡可誘導嚴重的炎癥反應，引起組織器官損傷，導致宿主死亡。NLRP3炎癥小體作為先天免疫的重要成分，通過激活caspase-1加工分泌成熟的促炎因子IL-1β、IL-18[7]，在細胞焦亡中發揮重要作用[8]。感染豬鏈球菌流行株導致的鏈球菌中毒性休克樣綜合征(STSLS)中，NLRP3炎癥小體被證實發揮了重要作用，使用MCC950抑制劑及NLRP3基因敲除鼠，小鼠STSLS癥狀明顯緩解[9]。NLRP3炎癥小體在感染過程中可以被病原體相關分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)激活，但損傷相關分子模式(danger-associated molecular patterns，DAMPs)的慢性激活對宿主是有害的。已有研究表明，在致死性甲型流感病毒感染的不同階段，阻斷NLRP3的激活可能具有保護作用，也可能是有害的[10]。目前大多數研究僅基于體外實驗證明NLRP3炎癥小體在Lm感染的巨噬細胞中具有清除細菌的作用，表明Lm感染可誘導caspase-1介導的巨噬細胞死亡[11]，激活多種炎癥小體[12-15]。但具體哪一種炎癥小體發揮主要作用尚無定論，爭議集中在NLRP3和AIM2兩者之中[16-17]，并且大多僅僅基于巨噬細胞體外模型的研究，對體內感染的研究較少。

本研究表明，Lm感染小鼠及巨噬細胞后均會引起細胞焦亡，且NLRP3炎性小體在細胞焦亡中發揮了重要的作用。Lm感染巨噬細胞后能誘導IL-1β的產生和分泌，ASC斑點的形成，及裂解片段caspase-1 p20、IL-1β-17的釋放，充分證明了NLRP3炎癥小體的激活。同時，在體內感染模型中，Lm感染的主要靶器官，脾、肝、腦組織均檢測到NLRP3炎癥小體的激活以及焦亡的發生。NLRP3炎癥小體特異性抑制劑MCC950能夠抑制Lm誘導的細胞焦亡。

本研究中GSDMD抗體能夠同時檢測出總片段和剪切后的活性片段，在小鼠組織中pro-GSDMD表達升高，同時發生剪切，產生具有活性的GSDMD-NT蛋白；而在THP-1巨噬細胞中，僅GSDMD-NT發生變化，這可能與THP-1巨噬細胞系有關，THP-1細胞經佛波酯誘導貼壁后，激活了某些炎癥通路，導致本底偏高，因此在Lm感染和MCC950加入后總蛋白表達變化不明顯。另外，由于ASC主要通過寡聚化聚合使炎癥小體激活，其表達量的變化與炎癥小體無直接聯系；炎癥小體是否激活主要看ASC斑點是否形成，對ASC蛋白表達的檢測不是必需的，因此未在小鼠組織中檢測ASC蛋白表達。

Lm是一種可穿越血腸屏障、血胎屏障、血腦屏障的病原菌，而NLRP3作為該菌的主要傳感器之一，可能在單核細胞增生李斯特菌相關的流產[18]、腦膜炎[19]、敗血癥等病理過程中發揮重要作用。對細胞焦亡及炎癥小體的深入研究，有助于更好地了解李斯特菌病的發生發展機制，特異性抑制劑MCC950的作用提示NLRP3可作為李斯特菌病治療新靶點。