腫瘤成纖維細胞通過外泌體 miR- 21促進膀胱癌細胞侵襲轉移

魏勇， 陳鵬， 朱洪儒， 陳全兵， 姜亞志， 錢文暉

(1. 南京市高淳人民醫院泌尿外科，江蘇 南京 211300； 2. 南京中醫藥大學附屬醫院泌尿外科，江蘇 南京 210029)

膀胱癌是全球第九大常見的惡性腫瘤，每年約有43萬新發病例，16萬人死于該疾病[1]。在中國，膀胱癌是最常見的泌尿系統腫瘤之一[2]。由于膀胱癌的早期癥狀并不典型，很多患者在出現血尿、膀胱刺激征等癥狀就診時，腫瘤細胞已經浸潤膀胱肌層或者出現遠處轉移，導致膀胱癌患者預后較差。而早期膀胱癌患者的預后明顯好于晚期患者[3]。因此，對膀胱癌侵襲、轉移的分子機制的研究將為膀胱癌發生、診治和提高生存率提供理論依據。近期越來越多的研究顯示，腫瘤間質在腫瘤的發生、發展中起著重要的作用[4]。作為腫瘤基質中的主要成分之一，腫瘤相關成纖維細胞(cancer-associated fibroblast, CAF)在胃癌、胰腺癌、肝癌等中具有促進腫瘤發生發展的作用[5-7]。然而有關CAF在膀胱癌發生發展中的作用報道仍較少。

1 材料與方法

1.1 主要材料

1.1.1 組織標本、細胞株 共收集34例于2015年1月—2018年12月在南京市高淳人民醫院行膀胱癌切除術患者的膀胱癌組織及對應癌旁組織標本。手術切除所得標本放置于液氮中直至進一步分析。所有標本均經本院病理科確診為膀胱癌，其中非浸潤性膀胱癌15例，浸潤性膀胱癌19例。所有患者在手術前均簽署了知情同意書，同意收集組織標本用于科學研究。利用組織塊貼壁法，分別從浸潤性膀胱癌和癌旁組織中提取CAF和正常成纖維細胞(normal fibroblasts, NF)。膀胱癌T24細胞購自上海中國科學院。

1.2 細胞培養及轉染

CAF、NF及膀胱癌T24細胞的常規培養用含有10%胎牛血清和抗生素(100 U/mL青霉素G和100 mg/mL鏈霉素)的DMEM培養基，置于37 ℃、5% CO2的細胞培養箱中培養。

細胞共培養時，將T24細胞按4×104/孔鋪于24孔板，按1 ∶1比例，取傳代3代后的CAF或NF種植于Transwell小室內，形成小室上層為CAF/NF細胞，下層為 T24細胞的共培養體系，共培養48 h后取T24細胞進行后續實驗。

1.3 外泌體提取及鑒定

采用外泌體提取試劑盒，在無菌條件下，提取CAF及NF分泌的外泌體。CAF及NF細胞以每孔5×105鋪于6孔板中，培養48 h后收集培養液，1500×g離心20 min，去除細胞碎片。吸取上清液按1 ∶4的比例加入ExoQuick 試劑，混勻后4 ℃孵育60 min后，1 500×g離心30 min，得到外泌體，加入200 μL無菌的PBS 重懸外泌體，并放入-80 ℃冰箱保存。取10 μL外泌體懸液滴加在載樣銅網上，靜置10 min后用2%磷鎢酸滴染色2 min，隨后在JEM-1010透射電鏡下觀察外泌體并拍照。

1.4 熒光實時定量PCR(qRT-PCR)檢測 相對表達量

1.5 免疫熒光觀察成纖維細胞中α-SMA的表達

將傳代3代以后的CAF及NF細胞培養72 h后，利用4%甲醛溶液固定20 min，0.3% Triton X-100 滲透 10 min，室溫封閉30 min，一抗α-SMA(1 ∶1 000配置)4 ℃孵育過夜。加入熒光標記二抗孵育30 min，避光。封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.6 Transwell實驗觀察CAF、外泌體及 對T24細胞侵襲、遷移的影響

1.7 蛋白質印跡檢測T24細胞中PTEN蛋白表達及外泌體表面標志CD9、CD63

檢測外泌體表面標志CD9、CD63蛋白時，利用RIPA裂解液抽提外泌體蛋白，余步驟同上，兔抗人CD9和CD63抗體按1 ∶1 000配置。

1.8 熒光素酶實驗

1.9 統計分析

2 結果

A：qRT-PCR檢測膀胱癌組織中 miR- 21的表達；B：免疫熒光觀察CAF中α-SMA表達(×400倍)；C：qRT-PCR檢測CAF中 miR- 21的表達

2.2 CAF可促進膀胱癌細胞侵襲遷移

將CAF或者NF與膀胱癌T24細胞共培養48 h后，Transwell侵襲遷移實驗結果顯示，相較于與NF共培養的T24細胞，與CAF共培養的T24細胞的侵襲、遷移能力更強(圖2)。

圖2 CAF促進膀胱癌T24細胞侵襲遷移(×100倍)

2.3 CAF通過外泌體釋放 促進膀胱癌細胞侵襲轉移

A：透射電鏡觀察外泌體形態(×80 000倍)；B：蛋白質印跡檢測外泌體CD9、CD63的表達；C：qRT-PCR檢測外泌體中 miR- 21的表達

A: CAF和NF外泌體孵育的T24細胞中 miR- 21的表達；B：分別與CAF和NF分泌的外泌體孵育的T24細胞的侵襲和遷移實驗；C：轉染陰性對照和 mimics的T24細胞的侵襲和遷移實驗

圖5 miR- 21可靶向抑制PTEN的表達

3 討論

越來越多的研究顯示腫瘤間質在腫瘤發生發展的過程中起著重要的作用[12]。CAF是腫瘤間質中含量最豐富的細胞之一，為腫瘤細胞提供支持性微環境，并誘導腫瘤細胞獲得更具侵襲性的能力[13]。

關于CAF在不同類型腫瘤的發生發展過程中所起作用及機制已有文獻報道。CAF可通過分泌細胞因子，如轉化生長因子β(TGF-β)、血管內皮生長因子(VEGF)、IL-6等，提供促腫瘤信號，促進腫瘤血管生成、侵襲轉移的發生[4]。但對于CAF在膀胱癌中的作用研究仍較少。Yang等[14]的研究揭示了CAF可通過釋放IL1β增強膀胱癌T24細胞增殖及侵襲的能力。Miyake等[15]發現高表達CXCL1的CAF可明顯提升膀胱癌細胞侵襲遷移的能力，并預示著較差的預后。Zhuang等[16]研究顯示CAF可通過釋放TGF-β引起膀胱癌細胞發生上皮間質轉換，促進侵襲遷移的發生。

miRNA可通過靶向眾多靶基因的3′-UTR來調節腫瘤細胞的發生和發展過程，這是一種重要的表觀遺傳調控機制。與此同時，miRNA可被細胞通過外泌體的形式釋放到細胞外，被受體細胞接受，調控受體細胞相應的功能。因此外泌體miRNA可充當腫瘤細胞與間質細胞間相互溝通的信使，受到廣泛關注[17]。目前尚無關于外泌體miRNA參與膀胱癌及CAF間相互作用的研究報道。