低氧對胰腺癌PANC-1細胞株中TWIST表達的影響

毛正發，羅鈞藝，李熙，馬小艷

(1. 江蘇大學附屬醫院普外科，江蘇 鎮江212001； 2. 江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江212013； 3. 江蘇大學附屬醫院婦產科，江蘇 鎮江212001)

胰腺癌是預后極差的消化道惡性腫瘤之一[1-2]。微環境低氧在胰腺癌發生發展中起著重要的作用[3]。低氧可誘導胰腺癌細胞上皮間充質轉化(epitheliale-mesenchymal transition，EMT)，從而增強遷移和侵襲[4]。不同部位消化道腫瘤，組織微環境低氧程度不同。胰腺癌組織的病理特征表現為高度成纖維細胞纖維化反應，組織缺乏血供，嚴重低氧的微環境。與預后較好的胃腸道腫瘤相比，胰腺癌更易發生復發和轉移，這提示胰腺癌高度侵襲性生物學行為可能與腫瘤微環境的極度低氧具有緊密的相關性。但是低氧如何促進胰腺癌的惡性生物學行為，其機制仍未完全清楚。

TWIST是一種高度保守的堿性螺旋-環-螺旋轉錄因子，對于脊椎動物的正常發育至關重要。已有研究表明，TWIST是一種促癌基因，在乳腺癌、胃癌、前列腺癌、黑色素瘤、膠質瘤、骨肉瘤等多種惡性腫瘤中均高表達[5-8]。胰腺癌中TWIST作為一種促癌基因，在組織中高表達且促進胰腺癌的進展[9]。低氧環境可以顯著誘導TWIST蛋白高表達，促進胰腺癌血管生成、EMT、轉移以及順鉑耐藥[10]。但是低氧環境誘導TWIST表達升高的具體機制尚未完全明確。

N6-甲基腺嘌呤(N6-methyladenosine，m6A)修飾是高等真核生物中含量最豐富的轉錄后修飾，是一種動態可逆的RNA修飾方式，主要由RNA甲基轉移酶、RNA去甲基化轉移酶和RNA甲基化修飾結合蛋白協同調控[11-12]。 m6A動態修飾在維持生理平衡中起著關鍵作用，異常的m6A修飾可能是腫瘤發生的重要誘因[13]。甲基轉移酶樣分子3(METTL3)是經典的m6A RNA甲基轉移酶，可以對mRNA進行m6A修飾。m6A修飾被不同的RNA甲基化修飾結合蛋白識別可引起不同類型的RNA代謝效應，包括mRNA的穩定性、pre-mRNA的加工剪接[14]、翻譯、出核[15]等。本研究探討了低氧環境對TWIST表達的影響及其可能的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

人單克隆抗體TWIST、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、波形蛋白、E-鈣黏蛋白、METTL3(美國Abcam公司)。其他化學品均為美國Sigma 公司或Fisher Scientific 公司產品。

1.2 細胞培養

人胰腺癌PANC-1細胞株購自美國ATCC， 置于RPMI-1640培養基中，于5%CO2空氣濃度，37 ℃條件下培養箱中培養。培養基補充有10%胎牛血清，2 mmol/mL谷氨酰胺，100 U/mL青霉素和100 U/mL鏈霉素；低氧培養持續通入94% N2∶5% CO2∶1% O2的混合氣體。

1.3 蛋白質印跡檢測低氧下PANC-1細胞TWIST蛋白的表達

將PANC-1細胞種于培養皿低氧培養0、12、24、48 h后收集細胞，使用RIPA緩沖液裂解并進行蛋白定量，根據檢測蛋白質分子質量的大小配置相應濃度的分離膠及濃縮膠。蛋白質變性后行SDS-PAGE，70 V 2 h；350 mA轉膜2 h，將凝膠分離的蛋白質轉移到PVDF膜上。PVDF膜洗滌后5% BSA封閉1h；TWIST一抗1 ∶1 000稀釋，4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次，每次10 min，加HRP偶聯的二抗(1 ∶2 000)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，然后用ECL試劑盒曝光檢測蛋白的表達。

1.4 免疫熒光檢測EMT相關蛋白的表達

將PANC-1細胞鋪板于蓋玻片上低氧培養48 h后，在室溫下用PBS洗滌細胞3次，并在冰上用4%多聚甲醛固定30 min。用含有5%山羊血清、2%驢血清、2% BSA、0.1%Tween-20和0.3%Triton X-100的PBS在室溫下封閉細胞1 h。PBS洗滌細胞3次，每次5 min，TWIST(1 ∶300)、α-SMA(1 ∶300)、波形蛋白(1 ∶200)、 E-鈣黏蛋白(1 ∶100)抗體稀釋后，4 ℃下孵育過夜。PBS洗滌細胞3次，每次5 min，二抗(Alex Fluro 594-標記的山羊抗小鼠IgG)以1 ∶4 000稀釋度常溫下孵育2 h。PBS清洗細胞3次，每次10 min。用PBS稀釋的DAPI染液(1 ∶3 000)，室溫避光孵育細胞15 min。孵育結束后用PBS清洗細胞5次，每次5 min。使用倒置共聚焦激光顯微鏡拍照。

1.5 蛋白質印跡檢測低氧條件下敲低TWIST后PANC-1細胞EMT相關蛋白的表達

1.5.1 質粒構建 針對TWIST的小干擾RNA(siRNA)由吉瑪公司設計和合成，TWIST序列如下：正向引物5′-GGACAAGCUGAGCAAGAUUCA-3′，反向引物5′-UGAAUCUUGCUCAGCUUGUCC-3′。TWISTScramble-序列：正向引物 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3′，反向引物 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3′。

1.5.2 病毒包裝 使用293T細胞在10 cm培養皿中培養至80%～90%融合時，接種于15 cm培養皿。傾去培養液，用1 mL D-Hank′s液洗滌細胞2次。加入1 mL胰蛋白酶-EDTA液, 混勻后，37 ℃放置2～3 min。小心吸去胰酶溶液，加入2 mL含10% 胎牛血清的DMEM，吹打使細胞形成單細胞懸液。將細胞懸液接種15 cm培養皿，加入18 mL含10% 胎牛血清的DMEM，混勻后37 ℃ 5% CO2培養過夜。在一支無菌的5 mL離心管中加入1.5 mL無血清DMEM，按比例加入穿梭質粒和包裝質粒(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)，混勻，取另一支無菌的5 mL離心管，加入1.5 mL無血清DMEM，再加入300 μL RNAi-Mate，混勻，室溫放置5 min后將兩管混合，室溫放置20～25 min。除去15 cm培養皿中的培養液，加入8 mL無血清的DMEM。將轉染混合物逐滴加入15 cm培養皿中，輕輕地前后搖晃培養皿以混勻復合物，在37 ℃、5% CO2培養箱中溫育4～6 h。吸棄轉染液，加入18 mL含10%胎牛血清的DMEM，37 ℃、5% CO2繼續培養72 h。

1.5.3 蛋白質印跡 將病毒轉染PANC-1細胞，在24孔板內加入8 μg/mL凝聚胺，37 ℃、5%CO2培養箱孵育0.5 h后，再選擇2孔分別加入對照病毒和目的病毒。繼續培養24 h后，用新鮮培養基替換含有病毒的培養基。對照組細胞轉染TWIST-siRNA 隨機序列，處理組細胞轉染TWIST-siRNA。低氧及常氧條件下培養，檢測TWIST敲低后EMT相關蛋白的表達，抗體按如下濃度稀釋：α-SMA(1 ∶1 000)、波形蛋白(1 ∶1 000)、 E-鈣黏蛋白(1 ∶500)，方法同步驟“1.3”。

1.6 檢測低氧條件下METTL3的表達

1.6.1 qRT-PCR檢測PANC-1細胞株中METTL3的表達 PANC-1細胞缺氧培養12、24、48 h后，收集細胞。使用Lighter Cycle-DNA Master SYBR Green Ⅰmixture (瑞士 Roche Applied Science公司)進行擴增反應。反應條件設置如下：95 ℃ 3 min，40個循環(95 ℃ 15 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s)。為確保擴增的特異性，每對引物的擴增產物都進行熔解曲線和電泳分析。METTL3引物序列：正向引物5′-GTCCATCTGTCTTGCCATCTC-3′，反向引物5′-GAGACCTCGCTTTACCTCAATC-3′。

1.6.2 蛋白質印跡檢測METTL3的表達 METTL3抗體1 ∶1 000稀釋，檢測方法同步驟“1.3”。

1.7 檢測低氧條件下PANC-1細胞總m6A水平

1.7.1 比色法檢測PANC-1細胞總m6A水平 按試劑盒說明配置系列標準樣品并制作濃度曲線。PANC-1細胞缺氧培養12、24、48 h后，收集細胞。按試劑盒說明配制待測樣品(與標準樣品等體積)，與標準曲線對比，計算出待測樣品m6A水平。

1.7.2 比色法檢測METTL3敲減后PANC-1細胞總m6A水平 針對METTL3的小干擾RNA(siRNA)由吉瑪公司設計和合成，METTL3序列如下：正向引物 5′-GCACUUGGAUCUUCGGAAUTT-3′，反向引物 5′-AUUCCGAAGAUCCAAGUGCTT-3′。METTL3Scramble-序列：正向引物 5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，反向引物 5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。病毒包裝及轉染同步驟“1.5.2”。對照組細胞轉染METTL3-siRNA 隨機序列，處理組細胞轉染METTL3-siRNA。蛋白質印跡檢測敲低效率。低氧及常氧條件下培養轉染后細胞48 h，比色法檢測敲低METTL3后細胞總m6A水平的影響，方法同步驟“1.7.1”。

1.8 檢測METTL3敲減后PANC-1細胞中TWIST的表達

1.8.1 qRT-PCR檢測METTL3敲減后TWISTmRNA的表達 PANC-1細胞轉染后缺氧培養48 h，收集細胞。使用Lighter Cycle-DNA Master SYBR Green Ⅰmixture(瑞士 Roche Applied Science公司)進行擴增反應。反應條件設置如下：95 ℃ 3 min，40個循環(95 ℃ 15 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s)。為確保擴增的特異性，每對引物的擴增產物都進行熔解曲線和電泳分析。TWIST引物序列：正向引物 5′-GTCCGCAGTCTTACGAGGAG-3′，反向引物 5′-GCTTGAGGGTCTGAATCTTGCT-3′。

1.8.2 蛋白質印跡檢測METTL3敲減后TWIST的表達 對照組細胞轉染METTL3-siRNA 隨機序列，處理組細胞轉染METTL3-siRNA。低氧條件下培養，蛋白質印跡檢測METTL3敲減后TWIST蛋白表達，方法同步驟”1.3”。

1.8.3 MeRIP-qPCR檢測METTL3敲減后TWISTm6A的表達 每組取30 μL Protein A/G PIUS-Agarose與適量的抗體混勻，于4℃旋轉混勻6 h左右；每組準備2皿細胞，棄去培養基，紫外線照射固定細胞；使用預先冰浴冷卻的PBS洗細胞2次，收集細胞沉淀；將裂解液加入細胞沉淀中，充分裂解。加入裂解液后在4 ℃下12 000 r/min離心10 min，取上清液，加入準備好的瓊脂糖珠-抗體混合液中，于4 ℃旋轉混勻過夜。將混勻液于4 ℃，1 000 r/min離心2 min，棄上清液；用冰浴冷卻的低鹽漂洗液洗瓊脂糖珠2次，每次5 min，冰上或4 ℃進行，1 000 r/min離心2 min，棄上清液。隨后再用高鹽漂洗液(300 mmol/L的NaCl)洗瓊脂糖珠2次，每次5 min，冰上或4 ℃進行，1 000 r/min離心2 min，棄上清液。qRT-PCR檢測步驟：用蛋白酶K溶液重懸瓊脂糖珠，55 ℃消化10 min，再用常規的Trizol法抽提RNA，用乙醇沉淀。 使用Lighter Cycle-DNA Master SYBR Green Ⅰmixture(瑞士Roche Applied Science公司)進行擴增反應。方法同步驟“1.8.1”。

1.8.4 蛋白質印跡檢測METTL3過表達后TWIST的表達METTL3-WT引物序列：正向引物 5′-CGGAATTCGCCACGAGACTGAAATGT-3′，反向引物 5′-GCGTCGACATAGATTCTTAGGTTTAGAGATGAT-3′，組裝至pcDNA3.1載體。METTL3-MUT sgRNA序列：正向引物 5′-GAAATTAATACGACTCACTATAggagcgcaccatcttcttcaGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGCTAGTCCG-3′， 反向引物5′-GAA ATTAATACGACTCACTATAGggtggtgcagatgaacttcaGTT TTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAG TCCG-3′，插入至pst1374-nirs-flag-cas9載體。轉染細胞后蛋白質印跡檢測TWIST的表達，方法同步驟“1.3”。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 低氧誘導TWIST高表達，促進胰腺癌細胞EMT

胰腺癌PANC-1細胞低氧培養后，隨著缺氧時間的增加，蛋白質印跡顯示TWIST蛋白的表達水平逐漸增加(圖1)。低氧培養48 h后，免疫熒光顯示PANC-1細胞中TWIST蛋白，間充質標志物α-SMA、波形蛋白的表達顯著升高，同時上皮標志物E-鈣黏蛋白表達下降(圖2)，表明低氧誘發胰腺癌細胞EMT。

*：P<0.01，與0 h比較

圖2 免疫熒光檢測低氧下PANC-1細胞EMT相關指標和TWIST表達(×100倍)

蛋白質印跡顯示，在常氧下轉染TWISTsiRNA后，PANC-1細胞中TWIST蛋白表達下降了60%，低氧濃度下表達下降了80%。在常氧濃度下，敲低TWIST表達后E-鈣黏蛋白的表達水平上升約2倍，α-SMA表達下降50%，波形蛋白表達下降約70%；在低氧濃度下，敲低TWIST表達恢復了E-鈣黏蛋白的表達增加了2倍，而α-SMA及波形蛋白的表達部分受到抑制，分別下降50%和75%，提示下調TWIST可以削弱低氧引起的EMT(圖3)。以上結果表明，低氧可以通過誘導TWIST高表達，促進胰腺癌細胞EMT。

#：P<0.01

2.2 低氧誘導METTL3表達，促進胰腺癌細胞的m6A水平升高

qRT-PCR及蛋白質印跡結果顯示，低氧處理的PANC-1細胞中，隨著時間的延長RNA甲基轉移酶METTL3的mRNA(P<0.01)和蛋白(P<0.01)表達逐漸增加，48 h后增加約4倍(圖4A、B)；比色法檢測細胞總m6A水平，結果顯示隨著低氧處理時間延長，細胞中總m6A水平升高(P<0.01)，48 h后增加80%(圖4C)。

蛋白質印跡顯示，轉染METTL3siRNA后，PANC-1細胞中METTL3蛋白表達下降40%(圖4D)。在常氧濃度下，敲低METTL3后，細胞中總的m6A相對表達水平輕度下降；在低氧濃度下，敲低METTL3后可顯著抑制低氧誘導的m6A水平升高，下降了45%(圖4E)。以上結果表明，低氧誘導METTL3表達，促進胰腺癌細胞的總m6A水平升高。

A、B： qRT-PCR 和蛋白質印跡檢測低氧條件下METTL3表達；C：低氧下細胞總m6A水平檢測；D、E： 構建METTL3穩定敲低的PANC-1細胞及其對照，常氧和低氧條件下檢測METTL3敲低效率和細胞總m6A水平。*：P<0.05，#：P<0.01

2.3 METTL3依賴于m6A修飾調控TWIST蛋白表達

qRT-PCR顯示，低氧條件下，穩定敲低METTL3后，PANC-1細胞中TWISTmRNA的表達未見明顯改變(圖5A)；但蛋白質印跡顯示，低氧條件下敲低METTL3后TWIST蛋白表達下降了60%(圖5B)。MeRIP-qPCR檢測結果顯示，低氧條件下敲低METTL3后， PANC-1細胞中TWISTmRNA m6A水平降低了20%(圖5C)。蛋白質印跡顯示，在PANC-1細胞中瞬時轉染METTL3-WT或METTL3-MUT后，METTL3-WT組TWIST蛋白表達較對照組升高2.2倍，而METTL3-MUT組無顯著變化(圖5D)。以上結果提示：METTL3依賴于m6A修飾調控TWIST蛋白表達。

A、B： METTL3穩定敲低的PANC-1細胞低氧處理48 h后，TWIST mRNA和蛋白表達；C： MeRIP-qPCR檢測TWIST RNA m6A水平；D：在PANC-1細胞中瞬時轉染METTL3-WT或METTL3-MUT質粒，蛋白質印跡檢測TWIST表達。*：P<0.05，#：P<0.01

3 討論

EMT指上皮到間質細胞的轉化，它賦予細胞轉移和入侵的能力，不僅在發育過程中起著關鍵的作用，而且還參與各種病理及生理過程[4]。E-鈣黏蛋白表達的缺失被認為是EMT的關鍵步驟。EMT誘導基因可以分為兩組，Snail家庭轉錄因子1、E盒結合鋅指蛋白1(ZEB1)、核轉錄因子E47和Krüppel樣轉錄因子8(KLF8)可以與E-鈣黏蛋白的啟動子結合并抑制其表達，TWIST等則間接抑制E-鈣黏蛋白的活性。EMT關鍵的步驟是上皮細胞到間充質細胞的轉化同時伴有極性的喪失，α-SMA和波形蛋白是經典的間充質標志物。本研究中免疫熒光及蛋白質印跡結果顯示，低氧處理胰腺癌細胞，TWIST蛋白表達隨著時間延長逐漸增加，上皮標志物E-鈣黏蛋白表達下降而α-SMA和波形蛋白明顯增加。而同等低氧條件下敲低TWIST表達后，E-鈣黏蛋白表達部分恢復而α-SMA和波形蛋白表達部分得到抑制，說明低氧可能通過調節TWIST的表達促進胰腺癌EMT。結果提示TWIST在胰腺惡性腫瘤適應低氧環境，促進腫瘤發生發展中起一定的作用。

微環境低氧是腫瘤的基本特征，在多種類型惡性腫瘤的發生發展中起著至關重要的作用，且與其他類型實體瘤相比，胰腺癌組織含氧量最低[3]。我們進一步觀察胰腺癌細胞中低氧條件是否影響METTL3表達及細胞總 m6A水平，結果顯示低氧處理后，RNA甲基轉移酶METTL3的mRNA和蛋白表達均顯著升高；同時胰腺癌細胞總m6A水平顯著升高，常氧條件下敲低METTL3表達后胰腺癌細胞m6A水平輕度下降，而低氧條件下敲低METTL3則顯著抑制m6A水平升高。這提示低氧可以通過誘導METTL3表達，顯著升高胰腺癌細胞的m6A水平。

為了研究胰腺癌細胞在低氧條件下，METTL3 m6A修飾功能與TWIST蛋白表達之間是否存在關系，我們構建了METTL3敲低PANC-1細胞系，結果顯示低氧條件下敲低胰腺癌細胞METTL3表達顯著降低TWISTmRNA的m6A水平，抑制TWIST蛋白表達，但對TWISTmRNA表達水平無顯著影響；過表達METTL3顯著上調TWIST蛋白的表達，而轉入METTL3突變質粒未見相關改變。結果提示METTL3依賴m6A修飾調控TWIST蛋白表達。

綜上所述，本研究結果提示，低氧通過誘導METTL3表達，以m6A依賴的方式調控TWIST蛋白表達。然而METTL3調節TWIST蛋白的具體機制有待進一步研究。