基于UPLC/Q-TOF-MS聯用技術探討糖尿病氣陰兩虛證生物標志物*

楊宇峰，石巖

遼寧中醫藥大學，遼寧 沈陽 110847

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一種由多種原因引起的以血糖升高為特征的慢性代謝性疾病。胰島素分泌不足（絕對或相對）以及靶組織或器官對胰島素敏感性的降低皆可導致本病的發生。《中國2型糖尿病防治指南（2020版）》中最新調查數據顯示，我國DM發病率目前已高達11.2%，且近年來呈明顯上升趨勢［1］。DM患者中以2型糖尿病（type 2 diabetes mellitus，T2DM）為主，中醫藥治療DM尤其是T2DM的臨床優勢突出，具有鮮明的診療特色，T2DM可以參照中醫內科疾病中的消渴病辨證論治。消渴病多以稟賦異常、過食肥甘、多坐少動，以及精神因素為發病原因，具體病機主要為內熱，內熱不僅可傷陰，又可耗氣，則成氣陰兩虛結熱之局，“傷陰耗氣”成為糖尿病病變的重要機理，貫穿疾病整個生物學變化過程［2］。

代謝組學是指通過對生物樣本中的低分子量代謝物（譜）進行定性和定量研究，從而反映機體的代謝物圖譜，揭示生命活動代謝本質，屬于后基因時代的一門新興“組學”學科。與基因組學、轉錄組學、蛋白組學相比，代謝組學能夠更加準確、直觀地描述機體的生理和生化狀態。目前，代謝組學已經用于評價實驗動物模型、判別中醫證型和評價藥物在體內靶器官的效應產生及一系列代謝過程和作用機制，在模型識別和確證、作用機制研究等方面具有理論意義和應用價值［3］。

本次研究以T2DM氣陰兩虛證動物模型為研究對象，通過超高效液相色譜與串聯四級桿飛行時間質譜儀（Ultra-performance liquid chromatography coupled with quadrupole time-of-flight mass spectrometry，UPLC/Q-TOF-MS）聯用技術分析各組模型大鼠差異代謝產物的種類及變化情況，確定其所具有的特征性“信息譜”，查找潛在的生物標志物，并與其分子基礎相關聯進行生物信息分析，以期闡明T2DM氣陰兩虛證候的生物學物質基礎。

1 材料

1.1 實驗試劑甲醇、乙腈，色譜純（美國Merck KGaA公司生產）；甲酸，色譜純（美國Tedia公司生產）；鏈脲佐菌素（批號：STZ-S0130，北京邦定泰克生物技術公司），其他試劑均為市售分析純。

1.2 實驗儀器超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯用儀（購自美國Waters公司），臺式離心機（型號：JX0130-F000，購自日本Kubota公司，離心半徑5 cm），超純水儀（型號：Milli-Q Advantage A10，Merck KGaA公司）。

1.3 動物雄性健康SPF級周齡10～12周的SD大鼠30只，體質量（180±20）g，購自遼寧長生生物科技有限公司，飼養于遼寧中醫藥大學動物實驗中心，動物合格證號：SCXK（遼）2004-0019。實驗室的溫度濕度保持在正常范圍內，通風良好，每天明暗各12 h。

2 方法

2.1 分組與造模大鼠用SPF級大鼠維持飼料適應性喂養1周后，用隨機數字表法分為正常組、模型組，每組15只。模型組全程喂飼高脂高糖飼料，灌服200%青皮附子濃煎液（5 mL·kg-1·d-1），4周后，禁食不禁水12 h后腹腔注射小劑量STZ（30 mg·kg-1）。正常組給予普通飼料，灌服生理鹽水（5 mL·kg-1·d-1），4周后，腹腔注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液。

2.2 模型評估標準（1）T2DM成模標準：①體質量顯著減少；②空腹血糖升高；③餐后血糖升高；④胰島素抵抗。（2）中醫證候成模評估標準：①精神萎靡，倦怠懶動；②體毛光亮度減退；③飲水增多，拉尾排便；④舌胖大，舌紅少津，苔白潤。同時符合以上4項中的3項或全部者即可確定為T2DM氣陰兩虛證模型。

2.3 樣本制備與處理將符合評估標準的模型大鼠和正常組大鼠禁食不禁水12 h后腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，劑量為3 mL·kg-1，然后進行腹主動脈取血。室溫靜置1 h并進行抗凝處理后，予10 000 r·min-1離心后取其上清液，凍存于-80℃冰箱。UPLC-Q-TOF-MS測定前，于室溫下解凍，取樣品100μL，加入色譜級乙腈-甲醇（1∶1）400μL，混勻振搖1 min，于4℃條件下進行12 000 r·min-1離心10 min，取200μL上清液進樣分析。

2.4 檢測條件①整個分析過程中樣品置于4℃自動進樣器中，進樣量5μL，柱溫40℃，流速0.4 mL·min-1；色譜流動相A：水+（體積分數）0.1%甲酸，色譜流動相B：乙腈+（體積分數）0.1%甲酸。②質譜條件：每份樣品分別采用電噴霧電離（ESI）進行正離子和負離子模式檢測，以氮氣作為霧化、錐孔氣，飛行管檢測模式V型。其ESI源條件如下：離子源溫度（source temperature）100℃、毛細管電壓（capillary voltage）3 KV、錐孔電壓（cone voltage）35 KV。離子掃描時間（Ion scan time）0.03 s，間隔時間（Interval time）0.02 s，數據采集范圍（Range of data collection）：50～1 000 m/z。

2.5 數據分析將所獲得的原始數據經MarkerLynx進行預處理后，獲取三維矩陣圖。應用軟件SIMCA-P11.5進行多維統計分析，包括無監督主成分分析（principal component avalysis，PCA）分析、有監督偏最小二乘法判別分析（partial least squares discrimination analysis，PLS-DA），根據t檢驗（P＜0.05）及VIP值＞1篩選潛在差異化合物。

3 結果

3.1 原始色譜圖檢查將所有質控樣本正、負離子檢測模式下的質譜總離子流圖分別進行譜圖疊加比較，如圖1所示：各色譜峰的響應強度和保留時間基本重疊，說明整個實驗過程中儀器誤差引起的變異較小，數據質量可靠。

圖1 模型組和正常組大鼠血清樣本UPLC/Q-TOF-MS總離子流圖

3.2 模式識別分析采用PCA和PLS-DA方法對全部樣本的UPLC/Q-TOF-MS數據進行分析，圖2為PCA分析結果，模型組和正常組樣本出現明顯的分離趨勢，圖3為進行PLS-DA方法分析的結果，同樣模型組和正常組樣本出現明顯的分離趨勢，說明兩組的代謝物存在顯著差異。通常情況下如果R2和Q2越接近1，則表明模型越穩定可靠，反之可靠性較差，本次實驗的結果為（R2X＝0.728，R2Y＝0.918，Q2＝0.953），說明其數據可靠性極高。

圖2 兩組大鼠血清樣本PCA分析圖（n=6）

圖3 兩組大鼠血清樣本PLS-DA分析圖（n=6）

3.3 顯著性差異代謝物的篩選根據模型組和正常組大鼠血清生物標記物進行PCA聚類loading圖的分析結果及離原點越遠的點對分組貢獻最大的原則，同時滿足VIP＞1、t檢驗（P＜0.05），篩選差異顯著的代謝產物，如圖4所示。檢索人類代謝組學數據庫（human metabolome database，HMDB）和京都基因與基因組百科全書數據庫（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）鑒定差異代謝物，結果發現，與正常組相比，模型組大鼠血清有41種代謝物變化較為顯著，如表1所示。支鏈氨基酸等代謝物水平顯著降低，硬脂酸等代謝物水平顯著上升。

圖4 模型組和正常組大鼠血清樣本PCA聚類Loading圖

表1 篩選出的潛在生物標志物及其變化趨勢

3.4 代謝通路分析將上述經篩選得到的生物標志物導入到Metaboanalyst 4.0數據庫進行分析，結果發現有6條通路與疾病相關，分別為：三羧酸循環、蛋白質、脂質及能量和碳水化合物的代謝、氧化應激。碳水化合物代謝涉及糖原異生和糖原生成的合成代謝途徑，以及糖原分解和糖酵解的分解代謝途徑。脂質代謝涉及脂肪酸生成及氧化分解代謝途徑。蛋白質代謝涉及氨基酸合成代謝途徑和氨基酸氧化分解代謝途徑。

4 討論

根據IDF在2019年發布的報告顯示：中國的DM發病率居世界首位，預計到2045年支出在DM的費用約為1 820億美元［4］。根據現代科學技術進行相關實驗研究其發病機制，開發出療效良好且價格低廉的藥物是有關DM研究的熱點。代謝組學可以對一定生理狀態或特定條件下的樣本中所有代謝物進行綜合全面、無偏性的高覆蓋檢測，可尋找和鑒定出不同樣品的差異代謝物，從而實現代謝特征的比較［5］，為精準研究T2DM常見中醫證型-氣陰兩虛型模型大鼠與正常大鼠的差異代謝產物提供了可行性。

本研究使用STZ聯合高脂飼料誘導T2DM大鼠模型，STZ是一種亞硝基脲類似物，1963年首次被報道具有DM的致病性［6］，其小劑量單次給藥適合誘導T2DM模型，肥胖是T2DM重要的病因［7］，DM尤其是T2DM早期患者大多會出現以高胰島素血癥、胰島素抵抗和血脂異常為特征的肥胖狀態［8-9］，故在STZ注射前使用高脂飼料全程喂養是造模成功的關鍵因素。相關文獻還顯示：8周高脂飼料喂養后進行STZ造模后生活質量較差，4周更佳，并可減少死亡率，節約實驗成本［10］；SD大鼠造模死亡率小于Wistar大鼠［11］；雄性大鼠比雌性大鼠對于STZ更加敏感［12-13］。上述研究結果可以作為本次小劑量STZ誘導的參考依據。使用青皮附子濃煎液灌胃可以最大程度真實模擬T2DM“傷陰耗氣”的發病過程，為目前氣陰兩虛證型造模的最佳選擇。

本實驗研究發現與正常組相比，T2DM氣陰兩虛證模型的代謝表達譜有明顯差異，其中11條與脂質代謝相關，10條與蛋白質代謝相關，8條與碳水化合物代謝相關，7條與氧化應激損傷代謝相關，5條與能量代謝相關。

4.1 碳水化合物代謝與正常組相比，模型組乳酸（lactic acid），山梨糖醇（sorbitol），D-塔格糖（Dtagatose）的水平顯著增加；1，5-脫水葡萄糖醇（1，5-anhydroglucitol，1，5-AG），D-赤蘚糖（Derythrose），D-半乳糖，磷酸葡萄糖酸內酯（gluconophosphate），1，6-二磷酸果糖（1，6-phosphate fructose）水平顯著降低。這些代謝產物與乳糖降解、多元醇代謝、半乳糖代謝、戊糖磷酸途徑、糖酵解代謝、糖異生等密切有關。其中山梨糖醇是葡萄糖的醛基還原而形成的山梨醇與半乳糖醇，模型組高血糖引起的異常山梨醇代謝增加了山梨醇在機體內的蓄積。1，5-AG是一個反映長期血糖穩定控制的標志物，在血清水平與循環葡萄糖成反比［14］，其在模型組內的水平顯著下降，一方面反映模型的復制成功，另一方面提示模型組大鼠存在嚴重的糖代謝紊亂。

4.2 脂質代謝相關研究已經確定脂肪酸是糖尿病的獨立預測因子。本實驗在模型組中觀察到多種游離脂肪酸（包括中鏈、長鏈、飽和、不飽和、多不飽和、支鏈和二羧酸脂肪酸）水平異常。其中模型組棕櫚酸（palmitic acid）、硬脂酸（stearic acid）、油酸（oleic acid）、亞油酸（linoleic acid）、月桂酸（lauric acid）、甘油磷酸鹽（glycerol phosphate）顯著升高。棕櫚酸是人體血清中豐富的飽和脂肪酸，研究報道棕櫚酸水平與T2DM風險之間存在正相關［15］。月桂酸和甘油磷酸鹽增加是由于脂肪組織中三酰甘油的快速動員導致血清游離脂肪酸水平增加。花生四烯酸代謝在T2DM的病理生理學中發揮潛在作用，花生四烯酸（arachidonic acid）可轉化為前列腺素，白三烯和脂氧素，其中前列腺素-E和白三烯是有效的促炎性脂質介質［16］。模型組氧化脂質如5-羥過氧化二十碳四烯酸（5-hydroxyperoxytetradecanoic acid）是體內白三烯生物合成過程中，花生四烯酸到白三烯A4的中間物質，參與介導炎癥并誘導白細胞在內皮上的黏附和活化。酰基肉堿（acylcarnitine）的升高可能與脂肪酸的β-氧化增加或肝臟和肌肉組織中的線粒體功能障礙有關，因為脂肪酸與肉毒堿的結合需要跨線粒體膜運輸和隨后的β-氧化［17］。3-羥基丁酸（3-hydroxybutyric acid，AHB）的水平顯著增加，研究表明AHB是胰島素抵抗的重要標志物，是α-酮丁酸通過乳酸催化反應脫氫酶或α-羥基丁酸脫氫酶代謝的產物［18］。

4.3 蛋白質代謝胰島素通過增加蛋白質合成速率并降低蛋白質降解速率，對蛋白質代謝發揮重要的調控作用。模型組大鼠的蛋白質分解代謝增強了胰島素抵抗，升高的支鏈氨基酸BCAAs（異亮氨酸，亮氨酸和纈氨酸）以及一些芳香族氨基酸（酪氨酸和苯丙氨酸）是人類和動物模型中T2DM的重要預測因子，BCAAs通過調控哺乳動物雷帕霉素復合物靶標（mTORC）影響胰島素敏感性。已有研究表明BCAAs首先激活mTORC1和下游靶核糖體蛋白S6激酶1（S6K1）［19］，S6K1通過抑制胰島素受體底物1信號傳導影響胰島素敏感性［20］。BCAAs還可促進肝臟和骨骼肌中的葡萄糖攝取，增加糖原合成［21］。一些蛋白質轉化產物如來自半胱氨酸的牛磺酸（taurine）和來自谷氨酰胺的γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid）也在模型組中升高，可能與模型組喂飼高脂高糖膳食破壞機體骨骼肌中的胰島素信號傳導，進而引起胰島素抵抗有關。模型組甘氨酸（glycine）水平減少與胰島素抵抗密切相關，胰島素抵抗可導致機體δ-氨基乙酰丙酸合酶1表達增強，進而催化甘氨酸和琥珀酰-CoA縮合成5-氨基乙酰丙酸，從而降低甘氨酸水平［22］。

4.4 氧化應激研究表明T2DM氣陰兩虛證模型存在著明顯的氧化應激損傷，氧化應激被認為在IR中起關鍵作用，IR情況下，線粒體β氧化能力處于飽和狀態，這是由于脂質向肌肉組織的遞送增加所致，從而使生物活性脂質衍生的代謝物如二酰基甘油（diacylglycerol）和神經酰胺（ceramide）在線粒體空間積累，并促進絲氨酸/蘇氨酸殘基的磷酸化來抑制IRS-1酪氨酸磷酸化［23］。實驗發現的2-氨基己二酸（2-aminoadipate）是賴氨酸降解的中間代謝產物，具有胰島素促分泌素的作用，并且已被認為是氧化應激的生物標志物［24］。除此，幾種氧化應激標志物包括還原型谷胱甘肽（reduced glutathione），蛋氨酸砜（methionine sulfone）和蛋氨酸亞砜（methionine sulfoxide），羥基十八碳二烯酸（hydroxyoctadecadienoic acid）也在模型組中被發現水平升高。

4.5 能量代謝T2DM氣陰兩虛證模型存在明顯能量缺乏狀態，其代謝特征最顯著變化是葡萄糖氧化代謝減少和脂肪酸β氧化代謝增加，增加的脂肪酸氧化補償葡萄糖氧化缺陷所產生ATP，表現為模型組檸檬酸（citric acid），L-蘋果酸（L-malic acid），α-酮戊二酸（α-ketoglutaric acid），琥珀酸（succinic acid），富馬酸（fumaric acid）與正常水平相比顯著降低。模型組肌酸酐（creatinine）增加，表明磷酸肌酸中更多的高能磷酸鍵被轉移形成ATP以滿足能量需求，并證實了模型組存在三羧酸（TCA）循環異常。此外，模型組增加的3-羥基丁酸酯（3-hydroxybutyrate）（脂肪酸β-氧化和BCAA分解代謝產物）表明能量代謝改變與糖酵解破壞和脂解作用增加正相關［25］。

綜上，本研究通過整體分析T2DM氣陰兩虛證模型生物樣本中小分子代謝物，同時應用多維統計、生物信息學等數據挖掘技術并結合相關性研究，探尋T2DM氣陰兩虛證相關的代謝標記物和代謝模式，為揭示DM中醫證型本質和闡明其發病機理提供了新的思路和依據，從而進一步促進DM中醫證候分子機制的深入研究和探討。