探討高通量測序技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

劉穎

摘要：本文首先分析了高通量測序技術(shù)的流程，然后主要論述了在食品微生物檢測中對高通量測序技術(shù)的應(yīng)用和應(yīng)用前景，如宏轉(zhuǎn)錄組測序、全基因組測序以及16SrDNA/rRNA測序等，希望可以為相關(guān)人員提供一定的參考，將該技術(shù)在食品微生物檢測上的優(yōu)勢進(jìn)行充分發(fā)揮，保證食品安全，維護(hù)國民健康。

關(guān)鍵詞：高通量測序;檢測技術(shù);食品微生物

引言：

食品微生物是影響食品安全性的關(guān)鍵因素，從近幾年市場監(jiān)督部門對食品抽查結(jié)果來看，食品存在的主要問題就是超量添加添加劑以及微生物超標(biāo)，兩個(gè)主要問題相比較危害較大是微生物超標(biāo)。基于此，檢測食品微生物的重要性不言而喻，需要將新一代生物學(xué)技術(shù)——高通量測序應(yīng)用在其中，保證檢測效果。

1高通量測序技術(shù)的流程

高通量測序技術(shù)的核心原理就是在連接合成的過程中同時(shí)進(jìn)行測序，不需要電泳技術(shù)，將DNA的確定方式轉(zhuǎn)變?yōu)榉治鲂潞铣赡┒藰?biāo)記，常見的主要流程為：首先，構(gòu)建DNA測序文庫。將寡核酸接頭增加到DNA樣品中，且保證該樣品的200到500bp為被打斷狀態(tài)，形成單鏈文庫。其次，完成變性與擴(kuò)增。即在測序文庫建成之后，將芯片表面和DNA片段兩端進(jìn)行連接，實(shí)現(xiàn)堿基互補(bǔ)，利用PCR的擴(kuò)增作用，將DNA進(jìn)行擴(kuò)鏈處理，在其成為雙鏈之后再次進(jìn)行解鏈，將最終產(chǎn)出的單鏈DNA的兩端放置在不同位置上，一端在芯片上進(jìn)行固定、并隨機(jī)將另一端與其附近的芯片引物進(jìn)行互補(bǔ)，構(gòu)成“橋”，利用這種變性循環(huán)和橋式擴(kuò)增，豐富DNA蔟，將堿基信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行不斷提升，直至達(dá)到要求。最后，將技術(shù)測序用可逆化學(xué)進(jìn)行隔斷，將經(jīng)過改造的核酸聚合酶加入其中，起到“可逆終止子”的作用，可以將單個(gè)堿基摻入到每個(gè)循環(huán)中，利用激光技術(shù)掃描芯片，進(jìn)行讀條，明確核苷酸類別，并再次進(jìn)行隔斷和讀條，以此類推，直至序列可以完成成為雙鏈，實(shí)現(xiàn)檢測目的[1]。

2在食品微生物檢測中對高通量測序技術(shù)的應(yīng)用分析

2.1宏轉(zhuǎn)錄組測序

該檢測方法屬于后基因組學(xué)生命科學(xué)的產(chǎn)物，可以幫助檢測人員深入分析各種已知的食品微生物，也可以幫助檢測人員分析未知的食品微生物，通過轉(zhuǎn)錄組情況，將研究對象設(shè)定為既定環(huán)境中的所有RNA，在既定時(shí)間中選擇合適的環(huán)境，將樣品微生物群落進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，開展大規(guī)模測序，從其整體來分析功能與微生物菌落等多種不同關(guān)聯(lián)，鑒定新的具有活性表達(dá)特性的微生物，在其基因表達(dá)量無法利用常規(guī)測序技術(shù)進(jìn)行表達(dá)的情況下應(yīng)用該檢測方法具有極大的現(xiàn)實(shí)作用，可以完善基因組學(xué)，保證檢測的完整性和科學(xué)性，維護(hù)食品安全。此外，該檢測方法可以有效進(jìn)行功能研究和調(diào)控表達(dá)，彌補(bǔ)基因組缺陷。例如，DeFilippis等人在檢測奶酪的過程中，利用宏轉(zhuǎn)錄組測序，研究與脂質(zhì)代謝、氨基酸、蛋白質(zhì)相關(guān)的微生物在奶酪成熟過程里的基因表達(dá)會(huì)出現(xiàn)明顯上調(diào)現(xiàn)象，表明在其成熟過程中，微生物功能和菌群會(huì)受溫度升高的影響而進(jìn)行改變，強(qiáng)化成熟率。

2.2全基因組測序

早在2011年，技術(shù)人員在研究微生物變異和病原菌遺傳方面應(yīng)用全基因組測序，該檢測方法可以核苷酸序列（位于整個(gè)基因組）進(jìn)行分析，實(shí)現(xiàn)分子分型，當(dāng)前運(yùn)用該檢測方法在對比分離株基因組方面的途徑主要有兩種，一種是基于全基因組，對單核苷酸進(jìn)行多態(tài)性分型，另一種則是對核心基因組進(jìn)行該分型操作。和傳統(tǒng)檢測方法相比，該檢測方法的發(fā)展前景和應(yīng)用價(jià)值更大，可以最大化的分析微生物基因組情況，有效識(shí)別其中存在的致病菌，從整體上將病原菌的遺傳信息、變異信息進(jìn)行現(xiàn)有技術(shù)水平下的全面反映，深入分析食品中的微生物情況，明確其是否存在具有加強(qiáng)耐藥基因的食源性致病菌，通過多種基因位點(diǎn)的設(shè)計(jì)分析，提升檢測精度和測序技術(shù)的分型能力，在一定程度上該檢測方法中的多態(tài)性分型在查找部分由食品引起傳染病情的源頭，延伸測序技術(shù)在食品檢測領(lǐng)域的應(yīng)用鏈，提升應(yīng)用價(jià)值[2]。

2.3 16SrDNA/rRNA高通量測序

該檢測該方法具有高度保守的功能和結(jié)構(gòu)，可以將食品微生物不同菌屬的差異性進(jìn)行有效體現(xiàn)，編碼核糖體中的其中16SrRNA亞基就用6SrDNA（基因序列）來表示。傳統(tǒng)研究16SrDNA序列多樣性的方法主要有兩種，一種是將基因組進(jìn)行擴(kuò)增，將已經(jīng)被擴(kuò)增處理的片段放入克隆體中，然后選擇檢測克隆文庫里面的所有序列，檢測方式為一代測序技術(shù);另一種則是在糞便PCR擴(kuò)增物上運(yùn)用凝膠電泳，明確其序列情況。兩種方法的成本都很高，且操作過于復(fù)雜的同時(shí)分辨率且并不高，不能將微生物特點(diǎn)進(jìn)行充分反映。而16SrDNA/rRNA高通量測序則可以擴(kuò)展檢測的覆蓋面，強(qiáng)化檢測深度，提升微生物檢測精準(zhǔn)程度，全面保證食品安全，可以將混合菌種進(jìn)行有效且較為快速的分類鑒定，并實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)定量，從而保證檢測結(jié)果的可靠性。

2.4宏基因組測序

單個(gè)微生物菌株可以進(jìn)行分離培養(yǎng)的數(shù)量較少，只有很少的部分才能進(jìn)行，而大量微生物的分離培養(yǎng)難以實(shí)現(xiàn)，而利用宏基因組測序（生物環(huán)境中所有微生物遺傳物質(zhì)之和）可以有效研究微生物基因功能、物種分類、群落結(jié)構(gòu)以及系統(tǒng)進(jìn)化等，降低對傳統(tǒng)檢測技術(shù)的依賴性，通過對食品樣本的采集和有效處理，可以明確其在食用過程中環(huán)境以及基因?qū)θ梭w的影響，鑒定食品微生物，其基本使用流程為在既定環(huán)境食品樣品中采集基因組DNA、選擇合適載體進(jìn)行DNA的克隆工作、將宿主菌體進(jìn)行導(dǎo)入、結(jié)合目的進(jìn)行篩選。其中。在采集DNA的過程中可以采用理化方法將微生物進(jìn)行破碎，釋放DNA，并結(jié)合實(shí)際需求進(jìn)行分離純化，載入載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化形成微生物無性繁殖系，測定混合基因組序列情況。

結(jié)語：

綜上所述，高通量測序技術(shù)是當(dāng)前生物技術(shù)中發(fā)展較為迅速的技術(shù)，在食品微生物檢測上可以有效鑒定食源性致病菌等微生物情況，避免帶有生物污染的食品流入市場，需要加大對該技術(shù)的應(yīng)用和研制，通過實(shí)際應(yīng)用推動(dòng)該技術(shù)的突破，保證其應(yīng)用質(zhì)量，維護(hù)食品安全。

參考文獻(xiàn)

[1]劉天一.我國食品微生物快速檢測技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀及趨勢[J].現(xiàn)代食品，2020（22）：86-88.

[2]袁佳煉，董林華.微生物檢測技術(shù)及其在食品安全中的應(yīng)用探析[J].現(xiàn)代食品，2020（21）：126-128.

（鹽城市大豐區(qū)綜合檢驗(yàn)檢測中心?江蘇?鹽城?224100）