探討高通量測序技術在食品微生物檢測中的應用

劉穎

摘要：本文首先分析了高通量測序技術的流程，然后主要論述了在食品微生物檢測中對高通量測序技術的應用和應用前景，如宏轉錄組測序、全基因組測序以及16SrDNA/rRNA測序等，希望可以為相關人員提供一定的參考，將該技術在食品微生物檢測上的優勢進行充分發揮，保證食品安全，維護國民健康。

關鍵詞：高通量測序;檢測技術;食品微生物

引言：

食品微生物是影響食品安全性的關鍵因素，從近幾年市場監督部門對食品抽查結果來看，食品存在的主要問題就是超量添加添加劑以及微生物超標，兩個主要問題相比較危害較大是微生物超標。基于此，檢測食品微生物的重要性不言而喻，需要將新一代生物學技術——高通量測序應用在其中，保證檢測效果。

1高通量測序技術的流程

高通量測序技術的核心原理就是在連接合成的過程中同時進行測序，不需要電泳技術，將DNA的確定方式轉變為分析新合成末端標記，常見的主要流程為：首先，構建DNA測序文庫。將寡核酸接頭增加到DNA樣品中，且保證該樣品的200到500bp為被打斷狀態，形成單鏈文庫。其次，完成變性與擴增。即在測序文庫建成之后，將芯片表面和DNA片段兩端進行連接，實現堿基互補，利用PCR的擴增作用，將DNA進行擴鏈處理，在其成為雙鏈之后再次進行解鏈，將最終產出的單鏈DNA的兩端放置在不同位置上，一端在芯片上進行固定、并隨機將另一端與其附近的芯片引物進行互補，構成“橋”，利用這種變性循環和橋式擴增，豐富DNA蔟，將堿基信號強度進行不斷提升，直至達到要求。最后，將技術測序用可逆化學進行隔斷，將經過改造的核酸聚合酶加入其中，起到“可逆終止子”的作用，可以將單個堿基摻入到每個循環中，利用激光技術掃描芯片，進行讀條，明確核苷酸類別，并再次進行隔斷和讀條，以此類推，直至序列可以完成成為雙鏈，實現檢測目的[1]。

2在食品微生物檢測中對高通量測序技術的應用分析

2.1宏轉錄組測序

該檢測方法屬于后基因組學生命科學的產物，可以幫助檢測人員深入分析各種已知的食品微生物，也可以幫助檢測人員分析未知的食品微生物，通過轉錄組情況，將研究對象設定為既定環境中的所有RNA，在既定時間中選擇合適的環境，將樣品微生物群落進行轉錄，開展大規模測序，從其整體來分析功能與微生物菌落等多種不同關聯，鑒定新的具有活性表達特性的微生物，在其基因表達量無法利用常規測序技術進行表達的情況下應用該檢測方法具有極大的現實作用，可以完善基因組學，保證檢測的完整性和科學性，維護食品安全。此外，該檢測方法可以有效進行功能研究和調控表達，彌補基因組缺陷。例如，DeFilippis等人在檢測奶酪的過程中，利用宏轉錄組測序，研究與脂質代謝、氨基酸、蛋白質相關的微生物在奶酪成熟過程里的基因表達會出現明顯上調現象，表明在其成熟過程中，微生物功能和菌群會受溫度升高的影響而進行改變，強化成熟率。

2.2全基因組測序

早在2011年，技術人員在研究微生物變異和病原菌遺傳方面應用全基因組測序，該檢測方法可以核苷酸序列（位于整個基因組）進行分析，實現分子分型，當前運用該檢測方法在對比分離株基因組方面的途徑主要有兩種，一種是基于全基因組，對單核苷酸進行多態性分型，另一種則是對核心基因組進行該分型操作。和傳統檢測方法相比，該檢測方法的發展前景和應用價值更大，可以最大化的分析微生物基因組情況，有效識別其中存在的致病菌，從整體上將病原菌的遺傳信息、變異信息進行現有技術水平下的全面反映，深入分析食品中的微生物情況，明確其是否存在具有加強耐藥基因的食源性致病菌，通過多種基因位點的設計分析，提升檢測精度和測序技術的分型能力，在一定程度上該檢測方法中的多態性分型在查找部分由食品引起傳染病情的源頭，延伸測序技術在食品檢測領域的應用鏈，提升應用價值[2]。

2.3 16SrDNA/rRNA高通量測序

該檢測該方法具有高度保守的功能和結構，可以將食品微生物不同菌屬的差異性進行有效體現，編碼核糖體中的其中16SrRNA亞基就用6SrDNA（基因序列）來表示。傳統研究16SrDNA序列多樣性的方法主要有兩種，一種是將基因組進行擴增，將已經被擴增處理的片段放入克隆體中，然后選擇檢測克隆文庫里面的所有序列，檢測方式為一代測序技術;另一種則是在糞便PCR擴增物上運用凝膠電泳，明確其序列情況。兩種方法的成本都很高，且操作過于復雜的同時分辨率且并不高，不能將微生物特點進行充分反映。而16SrDNA/rRNA高通量測序則可以擴展檢測的覆蓋面，強化檢測深度，提升微生物檢測精準程度，全面保證食品安全，可以將混合菌種進行有效且較為快速的分類鑒定，并實現精準定量，從而保證檢測結果的可靠性。

2.4宏基因組測序

單個微生物菌株可以進行分離培養的數量較少，只有很少的部分才能進行，而大量微生物的分離培養難以實現，而利用宏基因組測序（生物環境中所有微生物遺傳物質之和）可以有效研究微生物基因功能、物種分類、群落結構以及系統進化等，降低對傳統檢測技術的依賴性，通過對食品樣本的采集和有效處理，可以明確其在食用過程中環境以及基因對人體的影響，鑒定食品微生物，其基本使用流程為在既定環境食品樣品中采集基因組DNA、選擇合適載體進行DNA的克隆工作、將宿主菌體進行導入、結合目的進行篩選。其中。在采集DNA的過程中可以采用理化方法將微生物進行破碎，釋放DNA，并結合實際需求進行分離純化，載入載體進行轉化形成微生物無性繁殖系，測定混合基因組序列情況。

結語：

綜上所述，高通量測序技術是當前生物技術中發展較為迅速的技術，在食品微生物檢測上可以有效鑒定食源性致病菌等微生物情況，避免帶有生物污染的食品流入市場，需要加大對該技術的應用和研制，通過實際應用推動該技術的突破，保證其應用質量，維護食品安全。

參考文獻

[1]劉天一.我國食品微生物快速檢測技術發展現狀及趨勢[J].現代食品，2020（22）：86-88.

[2]袁佳煉，董林華.微生物檢測技術及其在食品安全中的應用探析[J].現代食品，2020（21）：126-128.

（鹽城市大豐區綜合檢驗檢測中心?江蘇?鹽城?224100）