龍眼核多酚對LPS 誘導的ALI 小鼠肺組織的保護作用及機制

范風穎，駱 姍，趙 莉

急性肺損傷（ALI）是臨床常見的肺部疾病，以持續或急性肺部炎癥為病理基礎，因嗜中性粒細胞聚集，損傷肺泡-毛細血管屏障，導致出現肺間質水腫、非心源性肺水腫等病理特征[1]。該病發生機制主要是因體內炎性水平升高、氧化應激反應增強導致，氧化應激會增加體內活性氧簇分泌量，引起氣道與血管重塑，并侵犯至肺間質，導致肺水腫發生[2]。在實驗動物模型建立時，常采用脂多糖（LPS）誘導，LPS是革蘭陰性菌主要細胞壁成分，是人體感染革蘭陰性菌的重要病原菌，其誘導作用是誘導機體炎癥反應過度激活，促進大量活性氧大量釋放，引起氧化與抗氧化系統失衡，故會導致肺損傷[3]。目前肺損傷缺乏特異性治療藥物，研究相關治療藥物是重癥科研究重點。龍眼也稱為桂圓，肉質清脆、味美香甜，果肉內含有豐富的碳水化合物、氨基酸、維生素C、蛋白質等營養物質，并含有豐富的多酚、多糖、多肽、皂苷類活性成分，有雙重的營養與藥用成分。中醫認為龍眼歸心、脾經，有補氣養血、安神定志、養心健脾功效。有研究[4]表明，除了龍眼肉，龍眼核有雙重的營養、保健功效，核內含有的脂肪、生物堿等成分，經多種分離純化技術并能從龍眼核內提取到多酚成分，起到抗氧化、抗炎、降血糖等作用。但龍眼核多酚是否能夠作為治療ALI 的相關藥物，以及其肺組織保護機制缺乏研究報道。現本研究就分析眼核多酚對ALI 小鼠的作用機制，報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 雄性小鼠40 只（新疆醫科大學動物實驗中心提供），SPF 級，周齡6～8 w，體重18～22 g；飼養環境SPF 級，室溫20～25 ℃，濕度40%～60%，自由攝食、飲水。

1.2 藥物與試劑 龍眼核：高州產地；地塞米松片：廣東華南藥業，國藥準字H44024469，0.75 mg/片；脂多糖：Sigma 公司；酶聯免疫法試劑盒購自羅氏公司；MR-96A 酶標分析儀購自深圳邁瑞生物；1658001 蛋白印跡電泳儀購自美國BioRad 公司；TD5-Ⅱ型離心機購自長沙平凡；SW-CJ-1FD 型超凈工作臺購自蘇州安泰。

1.3 龍眼核多酚提取 將龍眼核研磨成粉，精密稱量后，過60 目篩，備用。粉末200 g，加入95%乙醇1 L，70 ℃環境下，對龍眼核粉末進行攪拌，提取3 次，每次作用3 h。合并提取液，離心15 min，3500 r/min，壓縮提取液至無醇味浸膏。添加蒸餾水后分散，石油醚脫脂，對其分別加入氯仿、乙酸乙酯等溶劑萃取，合并萃取液，再壓縮、回收，對不同濃縮物進行干燥，液-液萃取法分離出龍眼核多酚。

1.4 動物模型建立 動物模型建立：小鼠得到1 w適應性喂養，模型建立前連續灌胃3 d，對照組、模型組分別腹腔注射等量生理鹽水，地塞米松組：腹腔注射地塞米松20 mg/kg；龍眼核多酚組：腹腔注射龍眼核多酚20 mg/kg，連續3 d，末次給藥1 h 后于小鼠尾部靜脈注射LPS 0.5 ml，建立ALI 模型，其中對照組僅注射等量生理鹽水。

造模完成24 h 后，摘除小鼠眼球，留取血液標本，對血液標本離心15 min，3500 r/min，將血液標本置于-20 ℃環境內保存。將小鼠處死后，開胸取左肺組織，吸干血跡后，電子秤測量肺組織濕重，隨后將肺組織置入60 ℃烘箱內，連續48 h 后測量干重，計算干濕重比值：濕重/干重。取肺組織，甲醛固定24 h，切片，HE 染色，用顯微鏡觀察肺組織病理特征，對肺泡水腫、肺泡充血、肺間質水腫、肺泡壁增厚，分別計0～4 分：0 分：無改變；1 分：輕微變化；2分：中度變化；3 分：重度改變；4 分：極重度改變。小鼠處死后，分離器官，左肺用磷酸緩沖液沖洗，連續3 次，收集灌洗液，離心10 min，2000 r/min，收集上清液，磷酸緩沖液重懸，涂抹在載玻片，以Giemsa 染色，計算嗜中性粒細胞、白細胞的數量，酶聯免疫吸附法檢測腫瘤壞死因子（TNF）-α、白細胞介素（IL）-6及IL-1β。留取的分離血液標本用WST-1 法檢測血清氧化應激指標：包括超氧化物歧化酶（SOD），測定肺組織內丙二醛（MDA）。分離提取細胞總蛋白后，用增強化學發光法計算高遷移率族蛋白（HMG）B1、核因子（NF）-κB 表達。

1.5 統計學方法 應用SPSS20.0 統計軟件分析。計量數據用x±s 表示，采用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗，P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺組織病理特征 對照組小鼠肺組織結構完整，肺泡腔內無滲出物，肺間質正常，肺泡間隔無增厚；模型組肺泡結構被破壞，肺泡腔炎性浸潤，肺間質水腫，肺泡間隔增厚明顯，病理平均分為（12.51±3.48）分；地塞米松、龍眼核多酚組肺泡腔炎性減輕，肺間質水腫緩解，肺泡間隔增厚不明顯，平均病理分分別為（4.81±1.63）、（5.02±0.65）分，地塞米松、龍眼核多酚組高于模型組（t=5.667，5.984；P=0.001,0.001）；而兩組比較無顯著差異（P>0.05）。

2.2 濕重/干重比值 對照組肺組織濕重/干重比值明顯低于其他3 組（P<0.05），而地塞米松、龍眼核多酚組較模型組下降（P<0.05），但地塞米松、龍眼核多酚組比較無顯著差異（P>0.05），見表1。

表1 4 組肺組織濕重/干重比值

注：與對照組比較,①P <0.05;與模型組比較,②P <0.05

2.3 炎性水平 對照組嗜中性粒細胞、白細胞計數、TNF-α、IL-6 及IL-1β 均低于其他3 組（P<0.05），而地塞米松、龍眼核多酚組較模型組下降（P<0.05），但地塞米松、龍眼核多酚組比較無顯著差異（P>0.05），見表2。

表2 4 組炎性水平比較

2.4 氧化應激反應 對照組SOD 表達高于其他3 組，MDA 表達低于其他3 組（P<0.05），而地塞米松、龍眼核多酚組SOD 表達高于模型組，MDA 表達低于模型組（P<0.05），但地塞米松、龍眼核多酚組比較無顯著差異（P>0.05），見表3。

表3 四組氧化應激反應比較

2.5 HMGB1、NF-κB 表 達 模 型 組HMGB1、NFκB 表達較對照組升高（P<0.05），而地塞米松、龍眼核多酚組表達有所下降，較模型組低（P<0.05），見表4。

表4 不同H MGB1、N-?B 表達比較

表4 不同H MGB1、N-?B 表達比較

注：與對照組比較，①P <0.05;與模型組比較，②P <0.05

3 討論

ALI 發病機制復雜、進展迅猛，其中革蘭陰性菌感染是其主要致病因素，誘發肺部炎性細胞浸潤及氧化應激反應，導致肺間質水腫、肺泡腔滲出[5-6]。脂多糖存在革蘭陰性菌細胞壁外膜，在注射脂多糖后會建立ALI 模型，為動物實驗展開奠定基礎[7-8]。本組研究，在用脂多糖誘導肺組織損傷小鼠模型，經初死解剖肺泡結構被破壞，肺泡腔炎性浸潤，肺間質水腫，肺泡間隔增厚明顯。故采用脂多糖誘導，能成功建立ALI 小鼠模型。本組研究，3 組小鼠的肺組織病理評分、肺組織濕重/干重比值均高于對照組，其中模型組增加明顯，地塞米松、龍眼核多酚有所下降（P<0.05）。結果證實采用地塞米松與龍眼核多酚能減輕小鼠肺組織病理損傷，緩解肺泡間質水腫，故肯定龍眼核多酚對肺組織有一定的保護作用。

ALI 是因炎癥細胞浸潤所致，外界環境改變，或促進嗜中性粒細胞活性，白細胞計數升高，產生過度炎癥反應，損傷肺組織上皮細胞[9-10]。本組研究，ALI 小鼠建立成功后，嗜中性粒細胞、白細胞計數、TNF-α、IL-6 及IL-1β 水平均明顯升高，且高于對照組，但在采用地塞米松、龍眼核多酚后其表達均明顯下降（P<0.05）。結果表明龍眼核多酚能夠下降小鼠炎癥反應。龍眼核含有的生物堿、多酚等成分，具備理化除濕、止血鎮痛作用，且在現代藥理[11]研究中，通過提取龍眼核相關物質，對多種病原菌起到不同程度的抑制作用，而多酚成分占龍眼核主要部分，故能肯定該物質的作用。氧自由基增強過度是致ALI 的重要原因，而且炎癥細胞通過浸潤肺組織，會促進氧化應激反應[12-13]。SOD 是內源性抗氧化系統的重要因子，MDA 是體內自由基脂質過氧化反應后形成的產物，兩者表達直接反映了肺組織損傷程度[14]。本組研究對照組SOD 表達高于其他3 組，MDA 表達低于其他3 組（P<0.05），而地塞米松、龍眼核多酚組SOD 表達高于模型組，MDA 表達低于模型組（P<0.05），但地塞米松、龍眼核多酚組比較（P>0.05）。結果證實在建立動物模型后，氧化應激反應明顯，而在用藥后可改善模型氧化損傷，以此能緩解肺組織炎性浸潤，降低炎癥水平。孫菡崢等[15]報道指出于龍眼核內提取多酚含量為53.68 mg/g，抗氧化性能高，對氧自由基的清除率(73.90±0.60)%。楊敦杰等[16]報道龍眼核內含有豐富的多酚類物質，50%乙醇萃取物之總多酚化合物含量最高，且清除超氧陰離子能力最高。本組研究，地塞米松、龍眼核多酚組HMGB1、NF-κB 表 達 均 低 于 模 型 組（P<0.05）。HMGB1 是反映肺損傷的重要因子，其表達可激活Toll 樣受體4/NF-κB 通路，導致肺損傷的發生[17-18]。研究提示龍眼核多酚通過下降HMGB1、NF-κB 表達，而起到保護肺組織的作用。

基于此，本研究認為龍眼核多酚通過抑制小鼠氧化應激反應，降低肺組織炎癥反應，起到肺組織保護作用，緩解肺損傷程度。雖然其作用與地塞米松的作用效果無明顯差異，但在長期臨床實踐中發現，地塞米松不良反應多，會誘發呼吸困難、過敏性休克、低鉀血癥等嚴重并發癥，此時為龍眼核多酚的臨床應用奠定基礎[19-20]。

綜上所述，龍眼核多酚通過減輕因LPS 誘導的ALI 小鼠的炎癥反應，抑制氧化應激反應，起到肺組織保護作用，緩解肺損傷程度。