雞滑液囊支原體的分離及生物學特性鑒定

鄭朝朝 鄒立宏 劉思桐 郁宏偉 趙玉龍 張新新/瑞普（保定）生物藥業有限公司 河北保定071000

雞滑液囊支原體（Mycoplasma Synoviae，MS）主要侵害商品肉雞、蛋雞或種雞，引起關節滲出性的滑液囊膜炎及腱鞘滑膜炎，是除雞毒支原體之外另一種引起家禽疾病的重要支原體病原，給國內外養禽業帶來了很大的危害。雞滑液囊支原體病主要通過疫苗免疫和抗菌藥物進行控制，目前我國主要依靠抗菌藥物控制該病。

本實驗旨在篩選敏感的抗菌藥物，為該發病蛋雞場合理用藥提供依據，對分離株的生物學特性進行研究，為開發雞滑液囊支原體疫苗提供材料。

1 材料

1.1 抗菌藥物抗菌藥物原粉均由瑞普(天津)生物藥業有限公司提供。

1.2 標準品標準陽性血清，標準陰性血清，MS 檢驗用菌株均購自中國獸醫藥品監察所。

2 方法

2.1 診斷2018 年，保定某中小型蛋雞養殖場，30%雞只發生跛行、癱瘓，采食量、產蛋量明顯下降，經了解未免疫雞滑液囊支原體疫苗，疑似發生雞滑液囊支原體疫情。用IDEXX 雞滑液囊支原體抗體檢測試劑盒對雞群ELISA 抗體水平進行檢測。

2.2 病料采集及分離培養無菌采集附關節內容物和爪墊內容物，置于改良Frey 氏液體培養基內，37℃培養，待培養基顏色變黃后，接種到新的液體培養基中，穩定傳代3 次。

將培養液接種到改良Frey 氏固體培養基，37℃培養7d，每天觀察。待低倍顯微鏡下發現典型支原體菌落，挑取單個菌落接種至改良Frey 氏液體培養基培養至顏色變黃。

2.3 分離鑒定

2.3.1 雞紅細胞吸附試驗取雞紅細胞懸液加入已培養好的固體培養基表面，室溫下作用20min 后棄去，生理鹽水洗滌2 次，在低倍顯微鏡下觀察菌落表面有無紅細胞吸附。

2.3.2 血清學實驗培養的菌液經12000rpm，30min 離心收集管底菌泥進行平板凝集試驗。

2.3.3 代謝抑制試驗

2.3.3.1 菌液稀釋 將培養的菌液用改良Frey 氏液體培養基稀釋1000 倍后備用。

2.3.3.2 標準陽性血清稀釋 取1ml 標準MS 陽性血清，用Frey 氏液體培養基進行2 倍梯度稀釋至第10 管，第10 管棄去1ml 混合液。

2.3.3.3 培養 將稀釋后菌液加至稀釋后陽性血清中，1ml/管，混合均勻后置于37℃培養，每天觀察、記錄培養液顏色變化。

2.3.2.4 對照設置 設置菌液滴度測定對照管。

2.3.4 PCR 擴增VlhA 基因根據GenBank 中基因序列，設計合成了一對特異性引物，預期片段大小為773kb。試劑盒法提取模板DNA 進行PCR 擴增。

2.3.5 雞胚感染實驗取培養的菌液經卵黃囊接種5 枚7日齡SPF 雞胚，0.2ml/胚。另設5 枚SPF 雞胚作為陰性對照。置37℃孵化器內繼續孵化，每日觀察并記錄雞胚死亡情況。

2.3.6 人工感染致病性實驗取培養的菌液經爪墊接種5只40 日齡SPF 雞，每只接種0.2ml。另設5 只SPF 雞注射改良Frey 氏液體培養基做為陰性對照。

2.4 免疫原性實驗和本動物攻毒保護實驗分離菌培養物滅活后制備成疫苗，備用。

分離菌制苗后接種21 日齡SPF 雞10 只，頸部皮下注射，0.5ml/只，同時設置空白對照、攻毒對照各10 只。

免疫后4w 測定血清抗體，免疫后30d，連同對照組每雞右腳墊注射0.2ml×106.0CCU 該分離株活菌，隔離飼養觀察14d，判定攻毒保護率。

2.5 抗菌藥物最小抑菌濃度測定

2.5.1 抗菌藥物稀釋配制各管抗菌藥物濃度分別為10μg/ml、5μg/ml、2.5μg/ml、1.25μg/ml、0.625μg/ml、0.3125μg/ml、0.1563μg/ml、0.0781μg/ml、0.0391μg/ml、0.0195μg/ml。

2.5.2 菌液稀釋將培養的菌液用改良Frey 氏液體培養基稀釋1000 倍備用。

2.5.3 最小抑菌濃度測定將稀釋后菌液加至稀釋后抗菌藥物中，1ml/管，混合均勻后置于37℃培養，每天觀察培養液顏色變化，直至第10d。

2.5.4 對照設置設置菌液滴度測定管。

3 結果與分析

3.1 臨床診斷ELISA 抗體檢測結果顯示，抽檢的96 份血清樣本中有78 份呈現陽性，雞滑液囊支原體抗體陽性率高于80%。

該雞場病雞狀態和病變符合雞滑液囊支原體發病特點，未進行免疫情況下ELISA 抗體陽性率高于80%，初步確定該場發生雞滑液囊支原體疫情。

3.2 病料采集及分離鑒定分離菌經瑞氏染色在油鏡下呈圓形或橢圓形，固體培養基上菌落表現為細小、光滑、半凹陷于培養基內，低倍鏡下觀察到菌落形態為特征性的“煎蛋狀”。

3.2.1 雞紅細胞吸附試驗分離菌菌落與紅細胞作用、鹽水洗滌后，在低倍顯微鏡下可見菌落表面有紅細胞吸附。

3.2.2 血清學實驗平板凝集試驗結果顯示，該分離菌能與MS 標準陽性血清發生凝集反應，而與MG 標準陽性血清不發生凝集反應。血清學試驗結果表明該分離菌為雞滑液囊支原體。

3.2.3 代謝抑制試驗培養至第5d，代謝抑制試驗對照管的培養液變為黃色，菌液滴度對照管第6 管變為黃色，血清對照管培養液顏色無變化，加有抗血清的第7 管變為黃色，其余3 管未變色。

培養至第7d，菌液滴度對照管第9 管變為黃色，血清對照管培養液顏色無變化，加有抗血清的第7 管為黃色，其余3 管未變色。

該分離菌的代謝抑制效價為128。

3.2.4 PCR 擴增Vlh A 基因PCR 擴增結果顯示分離株和檢驗用株均能擴增出特異性的目的片段，大小約773bp，而MG-CR 株未能擴增出任何條帶。（圖4）

圖4 PCR 產物瓊脂糖凝膠電泳圖

測序結果顯示，分離菌株與NCBI 登陸的基因同源性為90%。

3.2.5 雞胚感染實驗接種該分離菌的SPF 雞胚于120～144h 全部死亡，對照組正常。卵黃液PCR 可擴增出特異性片段。

3.2.6 人工感染實驗接種該分離株的5 只SPF 雞均出現特征性病變：爪墊腫脹突出，剪開后有淡黃色黏性滲出物，PCR 能擴增出雞滑液囊支原體預期大小的片段。對照組SPF雞后食欲正常，關節處均未見腫脹。

3.3 免疫原性實驗和本動物攻毒保護實驗抗體檢測結果顯示：免疫后2 周血清MS 抗體陽性率30%，免疫后3 周血清MS 抗體陽性率50%，免疫后4 周血清抗體陽性率為100%。

攻毒保護結果顯示：攻毒對照組攻毒后6d 開始個別雞只跗骨、胸骨腫脹，免疫組無明顯眼觀變化。攻毒后14d，攻毒對照組7/10 發病，免疫組3/10 發病。（表1）

表1 分離株制苗后免疫原性

3.4 抗菌藥物最小抑菌濃度測定最小抑菌濃度（MIC）實驗結果顯示：稀釋前菌液滴度為109.0CCU，陽性對照管于培養第4d 全部變色，而陰性對照管培養至第10d 未變色；抗菌藥物的實驗管不同程度變色。

表2 各抗生素對分離株最小抑菌濃度

上述結果顯示該分離菌對沃尼妙林敏感性最高，MIC 約為0.0195μg/ml；對林可大觀、泰萬菌素、泰妙菌素、泰樂菌素較為敏感；而對氟苯尼考、替米考星和恩諾沙星有耐受。

4 討論

本研究對病雞跗關節、爪墊滲出液樣品進病原分離鑒定，分離菌在固體培養基上菌落形態為特征性＂煎蛋狀”，結合進一步的紅細胞吸附試驗、血清學實驗、代謝抑制試驗、PCR擴增及人工感染試驗確診為雞滑液囊支原體。

本研究中分離的MS 菌株對SPF 雞有較強的致病性，動物回歸實驗可致SPF 雞出現典型的臨床癥狀，將此分離株制備成滅活疫苗對攻毒有7/10 保護，可做為MS 疫苗株候選株。

本研究對分離菌株選用了8 種抗菌藥物進行藥物敏感試驗，對臨床防治雞滑液囊支原體有重要的指導意義。□