circLMNB1誘導調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激介導結直腸癌轉移發(fā)生

何春萍 黃超 周瑞 孫軍 阮鵬 于紅剛 姚濤

武漢大學人民醫(yī)院1消化內(nèi)科，2神經(jīng)內(nèi)科（武漢430060）

結直腸癌（CRC）是最常見的惡性腫瘤之一［1］，超過50%的CRC患者將在其一生中發(fā)生肝轉移［2］。目前對于轉移性晚期CRC 尚無有效治療方法。絕大多數(shù)CRC 病例是散發(fā)性的和非遺傳性的［3］。大量的CRC 零星的腫瘤前病變逐漸積累了遺傳和表觀遺傳修飾，使細胞增殖和存活不受控制，并逐步發(fā)展成為具有典型的浸潤和轉移特性［4］。了解這些轉變的分子機制，對于優(yōu)化CRC 的治療策略非常重要。環(huán)狀RNA（circRNA）是一種保守且穩(wěn)定的共價閉合的RNA，它可能是潛在的疾病標志物［5］。ZENG 等［6］發(fā)現(xiàn)，circHIPK3 在結直腸癌的生長與轉移過程中起到關鍵的調(diào)控作用。越來越多的研究聚焦于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激在腫瘤中的作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激被證明可誘發(fā)細胞凋亡［7］。腫瘤的發(fā)生發(fā)展與細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激失調(diào)存在相關性［8］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的激活可以誘導CRC 細胞凋亡，抑制腫瘤發(fā)生與發(fā)展［9］。而circRNA 與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激之間存在調(diào)控關系。circHIPK2 可通過調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激機制，控制星形膠質(zhì)細胞的激活［10］。然而，目前在結直腸癌中，通過circRNA 調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激機制，干預腫瘤發(fā)生進展的鮮有報道。本研究首先對circLMNB1 在CRC 組織和癌旁組織及細胞系中的表達特征進行探索，隨后，在CRC 細胞中對circLMNB1 表達進行干預，進而檢測細胞的遷移和侵襲能力，同時對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激機制進行探索。本研究將明確circLMNB1 在結直腸癌的作用機制，為結直腸癌的治療提供潛在的分子靶點。

1 資料與方法

1.1 一般資料研究收集2017年4月至2018年5月武漢大學人民醫(yī)院胃腸外科20 例結直腸癌患者結直腸癌組織，并同時收集患者癌緣（3 ～5 cm）處組織作為癌旁組織。病例年齡在40 ～75 歲之間。納入標準：a.經(jīng)病理及影像檢查確診為結直腸癌；b. 未合并其他結直腸疾?。籧. 未合并其他腫瘤；d.術前無放化療史。排除標準：a. 病理確診排除結直腸癌；b.合并其他腫瘤；c.術前經(jīng)放化療。研究開展前，經(jīng)武漢大學人民醫(yī)院倫理審查委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和細胞系實驗中所采用的結直腸癌細胞系LoVO 和HCT116 均購于中科院細胞庫。circLMNB1 siRNA 由蘇州吉瑪生物設計并合成，circLMNB1 過表達載體pcircRNA2.2 由廣州伯信生物提供，用于細胞培養(yǎng)的RPMI 1640 細胞基礎培養(yǎng)基購自賽默飛旗下品牌Gibco，Transwell 小室由美國康寧公司提供。CHOP（A00311），ATF6（A00655）和GAPDH（A00227）一抗由博士德生物提供，HRP標記的山羊抗兔（ab6721）二抗由Abcam 公司提供。

1.3 細胞培養(yǎng)復蘇后的細胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基中，在5%CO2、37℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2 d 更換一次培養(yǎng)基。當密度達到85%以上時，進行細胞傳代。

1.4 免疫印跡加入RIPA裂解液到細胞中充分混勻，于冰上裂解30 min 后離心，獲得總蛋白液。測得樣品總蛋白含量后，計算上樣量。取20 μg 總蛋白進行SDS-PAGE 凝膠電泳，經(jīng)轉膜、5%脫脂奶粉封閉后，依次進行一抗孵育過夜、TBST 洗滌3 次、二抗室溫下孵育1 h，隨后進行顯色和曝光。

1.5 Transwell 遷移和侵襲實驗培養(yǎng)板中加入胰蛋白酶處理后制備單細胞懸液，接種到上室，并放入培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。實驗結束后，取出小室進行固定和染色。取下小室底置于載玻片上，中性樹脂封片，觀察記錄多個視野下的遷移和侵襲的細胞數(shù)目。所有實驗重復三次。

1.6 實時熒光PCR取50 mg 大小臨床組織或5×105個細胞，進行總RNA 的提取。使用TRIzol 方法提取組織或細胞中的總RNA，并將提取的總RNA逆轉成為cDNA。cDNA 模板采用如下引物進行qRT-PCR 實驗。GAPDH：F，5′-CCAGCCGAGCCACATCGCTC-3′；R，5′-ATGAGCCCCAGCCTTCTCCAT-3′。circLMNB1：F，5′-GCCAAAATTGAATGCTGTCC-3′；R，5′-TGAGATAGCCCAGCAATCCT-3′。以GAPDH 的表達為內(nèi)參，計算circLMNB1 相對表達水平。

1.7 患者臨床特征分析對納入的結直腸癌患者的基本信息及臨床特征，包括性別、年齡、腫瘤大小、轉移情況及TNM 分期情況。

1.8 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0 進行數(shù)據(jù)分析。兩組間數(shù)據(jù)分析采用t檢驗方法；多組間統(tǒng)計分析采用單因素方差分析進行差異分析。計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差表示，使用Graphpad 8.0 作圖。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 circLMNB1 的表達特征qRT-PCR 結果顯示，circLMNB1 在結直腸癌患者的癌組織中表達水平顯著高于癌旁組織（P＜0.01，圖1A）。另外，circLMNB1 表達水平與臨床患者特征之間的關系分析見表1。

表1 CRC 患者特征Tab.1 Features of patients with CRC 例

circLMNB1 表達水平與年齡和性別均不存在顯著性的差異（P＞0.05）。而腫瘤大小、轉移情況均與circLMNB1 表達水平存在顯著的相關性（P＜0.05）。然而，TNM 分期與circLMNB1 表達并不存在相關性（P＞0.05）見表1。

同時，在人正常結直腸粘膜細胞FHC和結直腸癌細胞系HCT116 和LoVo 中，circLMNB1 的表達水平也存在顯著差異。circLMNB1 在LoVo 和HCT116細胞系中的表達水平較FHC 細胞顯著上調(diào)（P＜0.05）。見圖1B。

圖1 circLMNB1 在結直腸癌臨床組織和細胞系中的表達特征Fig.1 Expression characteristics of circLMNB1 in Clinical tissues and Cell Lines of Colorectal Cancer

2.2 circLMNB1 對結直腸癌細胞遷移和侵襲能力的影響分別采用circLMNB1 和circLMNB1 siRNA轉染細胞，以對circLMNB1 進行過表達和干擾表達（圖2A）。在HCT116 進行circLMNB1 過表達后，其遷移和侵襲能力均出現(xiàn)顯著增強（P＜0.05）；而在LoVo 細胞中，采 用siRNA 對circLMNB1 進行敲降后，細胞的遷移和侵襲能力均顯著減弱（P＜0.05）。

圖2 circLMNB1 對結直腸癌細胞遷移、侵襲能力的影響Fig.2 Cell migration and invasion was changed by circLMNB1 knockdown or overexpression in CRC cell line

2.3 circLMNB1 對結直腸癌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激機制影響在HCT116 中對circLMNB1 進行過表達后，CHOP 和ATF6 的表達水平出現(xiàn)顯著的下調(diào)；而在LoVo 細 胞中，使 用siRNA 對circLMNB1 進行表達干擾后，CHOP 和ATF6 的表達水平則出現(xiàn)顯著的上調(diào)（圖3）。

圖3 circLMNB1 對結直腸癌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關蛋白CHOP 和ATF6 表達水平影響Fig.3 Expression of CHOP and ATF6 was changed by circLMNB1 knockdown or overexpression in CRC cell line

3 討論

circRNAs 是一種通過選擇性剪接形成的內(nèi)源性RNA，廣泛分布于真核細胞中［11］。環(huán)狀RNA 由于其封閉的環(huán)狀結構，不易被內(nèi)切酶降解，比線性RNA 更穩(wěn)定［12］。目前被當作腫瘤診斷標記物而進行廣泛的研究［13］。如has_circRNA_102209 被證明其在結直腸癌中表達上調(diào)，并可通過miR-761對腫瘤的增長與轉移進行調(diào)控［14］。本研究結果發(fā)現(xiàn)，circLMNB1 在結直腸癌組織中的表達較癌旁組織高，同時，在結直腸癌細胞系中的表達水平較正常細胞高；進一步的分析初步得知，circLMNB1表達水平與患者腫瘤的大小、轉移情況存在顯著的相關性，但仍有待進一步擴大樣本，進行綜合分析。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激被證實參與結直腸癌的轉移過程［15］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)建立了獨特的方式來對抗應激，統(tǒng)稱為未折疊蛋白反應（unfolded protein response，UPR）［16］。在應對來自外界的刺激時，細胞通常通過一系列的信號分子進行調(diào)控，如ATF6、CHOP等［16］。研究表明，ATF6/CHOP 信號參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激調(diào)控，并誘導細胞發(fā)生凋亡［17］。XU 等［18］的研究證實，F(xiàn)OXD3 可通過激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，促進結直腸癌細胞的凋亡。HUANG 等［19］的最新研究表明，TSPYL5 可通過誘導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激CHOP 等內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關蛋白表達，促進結直腸癌細胞的凋亡，抑制細胞的遷移、侵襲等生物學行為。本研究發(fā)現(xiàn)，circLMNB1 的過表達引起結直腸癌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激變?nèi)?，同時伴隨遷移和侵襲能力增強。但是對circLMNB1 進行干擾，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激則增強，同時，細胞遷移和侵襲能力變?nèi)酢＝Y果表明，circLMNB1 可以調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，具有潛在的調(diào)控腫瘤細胞遷移和侵襲能力的作用。

總之，circLMNB1 可作為結直腸癌診斷的生物標記物，它可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的方式參與結直腸癌的發(fā)生與進展。circLMNB1 的這種潛在價值，有望成為臨床診斷的標記物及治療靶標。