長鏈非編碼RNAs-微小RNAs-mRNAs調(diào)控軸在腦缺血/再灌注損傷機制中的作用進展

李俊杰 邵建林

昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院麻醉科（昆明650032）

缺血性腦卒中是一種常見且高發(fā)的腦血管病，其發(fā)生率約占所有卒中的87%［1］。缺血性腦卒中發(fā)生后血流的再通導致缺血組織損傷加重的現(xiàn)象，稱為腦缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷。再灌注損傷的機制復雜多樣，與細胞凋亡、氧化應激、神經(jīng)炎癥、興奮性氨基酸毒性、細胞自噬以及血腦屏障破壞等病理過程密切相關(guān)［2］。長鏈非編碼RNAs（long non-coding RNAs，lncRNAs）和微小RNAs（microRNAs，miRNAs）在許多生物過程的基因表達調(diào)控中發(fā)揮重要作用［3-4］。lncRNAs是近年發(fā)現(xiàn)的能夠在表觀遺傳水平、轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達進行調(diào)控的一類非編碼RNAs，miRNAs 則發(fā)揮了切割mRNAs，保持mRNAs的穩(wěn)定性以及抑制翻譯的作用［5］。lncRNAs 主要通過競爭性內(nèi)源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）機制，作為miRNAs 的內(nèi)源性“海綿”抑制miRNAs 的表達，從而抑制了miRNAs 對mRNAs 的負性調(diào)控作用；此外，也有部分lncRNAs 能與miRNAs 競爭mRNAs 的3′端結(jié)合位點，直接與mRNAs結(jié)合，解除了miRNA對mRNA的抑制作用［6］（圖1）。近年來，越來越多的研究表明lncRNAs-miRNAsmRNAs 調(diào)控軸在諸多方面參與了腦I/R 損傷病理過程的調(diào)控。本文將從以下幾個方面對近年關(guān)于lncRNAs-miRNAs-mRNAs 調(diào)控軸在腦I/R 損傷中的作用及其機制的研究進行總結(jié)與分析，為腦I/R損傷的分子機制及治療靶點的選擇提供理論依據(jù)和參考。

圖1 lncRNA 和miRNA 的作用及調(diào)控mRNA 的作用機制示意圖Fig.1 Schematic diagram of the roles of lncRNA and miRNA and the mechanism of regulating mRNA

1 lncRNAs-miRNAs-mRNAs 軸與腦I/R 損傷后細胞凋亡

細胞凋亡是由基因控制的細胞自主的有序死亡過程，在腦I/R 損傷過程中發(fā)揮了重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA TUG1 和MALAT1 在腦I/R 損傷后的星形膠質(zhì)細胞和小鼠腦組織中高表達，二者均能通過吸附miR-145而上調(diào)AQP4的表達，促進了腦I/R 損傷后細胞凋亡［7-8］。lncRNA KCNQ1OT1 在I/R后的大腦皮質(zhì)神經(jīng)元中表達上調(diào)，并通過與miR-9的反應元件結(jié)合抑制其表達，解除了miR-9 對靶基因MMP-8的表達抑制，從而誘導神經(jīng)元發(fā)生凋亡［9］。KCNQ1OT1還能通過lncRNA KCNQ1OT1-miR-153-3p-Foxo3調(diào)控軸，以相同的作用方式促進腦I/R損傷后皮質(zhì)神經(jīng)元的凋亡［10］。另一項研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA CHRF 在I/R 損傷后小鼠腦組織中高表達，同時，敲低CHRF 基因表達能通過靶向調(diào)控miR-126/SOX6 通路抑制細胞凋亡，改善腦I/R 損傷［11］。此外，下調(diào)lncRNA H19可通過與miR-19a競爭結(jié)合靶基因Id2 的3′端間接抑制Id2 的表達，改善Id2 高表達所致的神經(jīng)元損傷［12］。lncRNA MEG3 也參與了腦I/R損傷后細胞凋亡的調(diào)控，它能通過ceRNA機制競爭性抑制miR-21a 的表達，從而上調(diào)靶蛋白PDCD4的表達，誘導缺血所致的神經(jīng)元凋亡［13］。上述研究表明，腦I/R 后大量的lncRNAs 呈高表達，并通過lncRNAs-miRNAs-mRNAs 軸促進神經(jīng)細胞凋亡，加重腦組織的再灌注損傷。然而，有極少數(shù)lncRNAs 在腦I/R 后高表達，可以抑制凋亡，抗I/R損傷。YIN 等［14］研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA SNHG12 在I/R后的海馬神經(jīng)元中高表達，抑制了miR-199a對靶基因SIRT1 的負調(diào)控，并激活AMPK 信號通路抑制了神經(jīng)元凋亡。

B 細胞淋巴瘤-2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）家族蛋白（Bcl-2、Bax）以及其下游的半胱氨酸蛋白酶3（cysteine protease-3，Caspase-3）在細胞凋亡的早期發(fā)揮了非常重要的調(diào)節(jié)作用，它們以酶原的形式存在于胞質(zhì)，并在一定條件下被激活后促進或抑制凋亡［15］。諸多研究證實lncRNAs-miRNAsmRNAs 調(diào)控 軸 能激活Bcl-2、Bax 或Caspase-3 途徑參與腦I/R 損傷后細胞凋亡的調(diào)控。lncRNA AK 038897 在腦I/R 損傷后小鼠腦組織和N2a 細胞中表達顯著上調(diào)，作為miR-26a-5p 的一個ceRNA 與DAPK1 競爭結(jié)合共同的miR-26a-5p 結(jié)合位點，通過lncRNA AK038897-miR-26a-5p-DAPK1 軸使Bax和Caspase-3 蛋白表達上調(diào)，Bcl-2 蛋白表達下調(diào)，加重了細胞凋亡［16］。相反的是，lncRNARian 在腦I/R 后表達顯著降低，過表達Rian 通過海綿吸附作用抑制了miR-144-3p 對靶基因GATA3 的負調(diào)控作用，從而抑制了Bax、Caspase-3 蛋白表達，激活了Bcl-2 的表達，發(fā)揮抗凋亡的保護作用［17］。lncRNA Oprm1 與lncRNA Rian 作用相似，定位在胞漿，腦I/R后Oprm1表達降低，過表達后通過lncRNA Oprm1-miR-155-GATA3 調(diào)控軸降低了Caspase-3 的蛋白表達［18］。此外，下調(diào)lncRNA Gm11974 的表達通過lncRNA Gm11974-miR-766-3p-NR3C2 軸激活Bcl-2和抑制Bax 蛋白表達，從而減少腦I/R 損傷后細胞凋亡［19］。綜上可見，腦I/R 損傷發(fā)生后對這些差異表達的lncRNAs 或其相應的調(diào)控軸進行干預可能對挽救I/R 損傷后神經(jīng)細胞的存活具有重要作用。

2 lncRNAs-miRNAs-mRNAs 軸與腦I/R 損傷后氧化應激損傷

氧化應激是導致腦I/R 損傷最常見和研究最充分的因素［20］。大量氧化物質(zhì)生成減少是造成氧化應激損傷的主要因素之一。lncRNA H19 參與的調(diào)控軸不僅能調(diào)控細胞凋亡，對氧化應激反應也具有調(diào)控作用。研究表明，lncRNA H19可作為miR-19a-3p的一個ceRNA，通過海綿吸附作用抑制其表達，從而使PTEN 上調(diào)，增加了MDA 和減少了SOD的產(chǎn)生，加重了I/R 后腦組織的氧化應激損傷［21］。另一項研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍抗氧化應激，保護腦I/R損傷的機制是通過抑制lncRNA H19-miR-148a-3p-Rock2 調(diào)控軸來實現(xiàn)［22］。同時，研究發(fā)現(xiàn)lncRNA KCNQ1OT1 在腦I/R 后表達顯著上調(diào)，通過靶向抑制miR-140-3p 促進了HIF-1α的表達，增加了ROS和MDA 的生成以及減少了SOD 的產(chǎn)生［23］。此外，lncRNA KCNQ1OT1 還參與了腦I/R 損傷所致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激（endoplasmic reticulum stress，ERS）的調(diào)控，KCNQ1OT1 表達上調(diào)后通過靶向作用于miR-30b-GRP78 軸，上調(diào)ERS 相關(guān)蛋白的表達，加重再灌注后ERS 所致的腦損傷［24］。lncRNA ROR 在I/R損傷的PC12 神經(jīng)細胞模型中表達顯著上調(diào)，通過調(diào)控miR-135a-5p/Rock1/2 軸加重再灌注損傷所致的氧化應激損傷［25］。然而，在腦I/R 損傷的SH-SY5Y 細胞模型中，lncRNA SNHG16 的表達則下調(diào)，過表達SNHG16 通過海綿吸附作用靶向抑制miR-106b-5p的表達，從而上調(diào)了LIMK1 的表達，最終減少了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關(guān)蛋白的產(chǎn)生，發(fā)揮了抗氧化應激的保護作用［26］。另一項體內(nèi)實驗表明，lncRNA NEAT-1在I/R 損傷后大鼠腦組織中表達上調(diào)，通過靶向抑制miR-214 并促進PTEN 的表達增加了氧化物質(zhì)MDA和連環(huán)蛋白（catenin，CAT）并減少了抗氧化物質(zhì)SOD 的產(chǎn)生，加重了腦組織的繼發(fā)性損傷［27］。由此可見，lncRNAs-miRNAs-mRNAs 調(diào)控軸在腦I/R 損傷中具有促氧化應激和抗氧化應激的雙向調(diào)控作用。

3 lncRNAs-miRNAs-mRNAs 軸與腦I/R 損傷后神經(jīng)炎癥

炎癥反應是造成腦I/R 后繼發(fā)性損傷的重要因素之一，再灌注早期，炎癥級聯(lián)效應被激活，大量的細胞因子的生成促進了炎癥反應，加重了腦組織的損傷［28-29］。lncRNA MEG3 及其調(diào)控軸不僅參與了細胞凋亡的調(diào)控，對神經(jīng)炎癥也具有調(diào)控作用。研究表明，在I/R 損傷后的大鼠腦組織和SH-SY5Y 細胞模型中，MEG3 的表達上調(diào)，并通過作為miR-485 的一個ceRNA，海綿吸附miR-485 抑制其表達，從而上調(diào)靶基因AIM2 的表達，最終增加了IL-1β和IL-18 的分泌，加重炎癥反應［30］。另一方面，lncRNA ZFAS1 則呈現(xiàn)低表達，過表達后通過調(diào)控miR-582/NOS3 軸，降低了腦組織和細胞上清液中TNF-α和IL-1β的產(chǎn)生，抑制了腦I/R 損傷所致的炎癥反應［31］。lncRNA H19 在I/R 后腦組織中高表達，如上文所述，H19 及其相關(guān)lncRNAsmiRNAs-mRNAs 調(diào)控軸參與了腦I/R 損傷后細胞凋亡和氧化應激的調(diào)控。lncRNA H19 可作為mi-138-5p 的分子海綿抑制其表達并上調(diào)了靶基因p65 的表達，從而增加了細胞因子的產(chǎn)生，促進了炎癥反應［32］。lncRNA KCNQIOT1 也參與了神經(jīng)炎癥的調(diào)控，體外研究表明，KCNQIOT1 通過靶向調(diào)控miR-140-3p/HIF-1α軸增加了細胞上清液中炎癥因子的分泌［23］。此外，ZHONG 等［33］還通過RNA 免疫沉淀和下拉實驗證實了lncRNA SNHG14 可作為miR-136-5p 的ceRNA，通過與ROCK1 競爭miR-136-5p 共同的結(jié)合位點抑制miR-136-5p 對ROCK1 的負調(diào)控作用，從而增加腦I/R 損傷后促炎細胞因子的產(chǎn)生，加重神經(jīng)炎癥反應［33］。

4 lncRNAs-miRNAs-mRNAs 軸與腦I/R 損傷后細胞自噬

自噬通過去除蛋白質(zhì)聚集體和破壞細胞器，以及回收自噬降解的副產(chǎn)品，對維持細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)具有重要意義，同時，它又是真核生物的重要降解途徑之一，并且與心腦血管疾病相關(guān)［34-35］。然而，過度自噬可促進腦I/R 損傷過程中神經(jīng)元凋亡，導致神經(jīng)細胞死亡［36］。已有研究證實lncRNAsmiRNAs-mRNAs 調(diào)控軸參與腦I/R 損傷后神經(jīng)細胞的自噬過程。腦I/R 后lncRNA SNHG3 表達上調(diào)，并作為miR-485 的ceRNA 抑制了miR-485 的表達，靶向上調(diào)了自噬相關(guān)蛋白ATG7 的表達，增加了LC3II/I 的生成，促進了自噬誘導的神經(jīng)細胞凋亡［37］。此外，lncRNA KCNQ1OT1 通過調(diào)控miR-200/FOXO3/ATG3 通路增加了I/R 損傷后神經(jīng)細胞的自噬通量（ATG3、LC3II/I 和SQSTM1 生成增加），誘導神經(jīng)細胞自噬，加重小鼠腦梗死和神經(jīng)功能障礙［38］。另一項體外研究表明，lncRNA Malat1 是一種有效的自噬誘導劑，在發(fā)生I/R 后的腦血管內(nèi)皮細胞中，Malat1 表達上調(diào)，通過海綿吸附抑制miR-26b 表達，靶向上調(diào)ULK2 的表達，促進自噬小體GFP-C3 生成和LC3-I 向LC3-II 蛋白轉(zhuǎn)化，誘導自噬，保護細胞免受I/R 所致的死亡［39］。

5 lncRNAs-miRNAs-mRNAs 軸與腦I/R 損傷其他病理過程

lncRNAs-miRNAs-mRNAs調(diào)控軸除了參與上述對腦I/R 損傷后細胞凋亡、氧化應激損傷、神經(jīng)炎癥和細胞自噬的調(diào)控外，有研究發(fā)現(xiàn)它還能參與細胞焦亡的調(diào)控。細胞焦亡是近年新發(fā)現(xiàn)的一種新的程序性細胞死亡方式，該過程也伴隨著大量促炎因子的釋放。GSDMD-N被認為是Caspase-1的底物，是一種參與焦亡途徑的蛋白。近期，LIANG 等［30］研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA MEG3 在I/R 損傷后的大鼠腦組織和SH-SY5Y 細胞模型中表達上調(diào)，并通過miR-485/AIM2 通路增加GSDMD-N 蛋白的表達，激活Caspase-1 介導的細胞焦亡途徑，促進隨之而發(fā)生的炎癥反應，加重神經(jīng)功能損傷。

腦I/R 損傷機制比較復雜，細胞凋亡、氧化應激損傷、神經(jīng)炎癥、興奮性氨基酸毒性、細胞自噬和血腦屏障功能受損等病理損傷過程彼此間相互交錯或促進，加重了腦組織缺血再灌注后的繼發(fā)性損傷。而從現(xiàn)有的研究來看，lncRNAs-miRNAsmRNAs 調(diào)控軸則通過各自的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與了腦I/R 損傷后細胞凋亡、氧化應激損傷、神經(jīng)炎癥、細胞自噬和焦亡過程的調(diào)控（圖2）。對該方面分子調(diào)控機制的研究將加深對該疾病病理機制的認識，也為治療缺血性腦卒中分子靶點的篩選拓展了新的視角，但離臨床治療應用還有很長的路要走，仍然需要進行深入研究探索。

圖2 lncRNAs-miRNAs-mRNAs 調(diào)控軸在腦缺血/再灌注損傷機制中的作用網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram of the role of lncRNAs-miRNAs-mRNAs regulatory axis in the mechanism of cerebral ischemia/reperfusion injury