不同地黃品種根際土壤真菌群落結構研究

吳廷娟 杜權 謝小龍

摘要 [目的]通過研究不同地黃品種根際土壤真菌的群落結構，以明確不同地黃品種的根際土壤中真菌的群落結構和組成是否具有差異，為優(yōu)選抗病性地黃品種提供數據支撐。[方法]通過采用傳統的平板培養(yǎng)和分離方法，將噸王、北京3號、沁懷、金九、金狀元、獅子頭6個地黃品種土壤中的真菌先進行純培養(yǎng)分離、鑒定和計數，然后提取初步分離得到的真菌菌株的DNA，采用基于ITS序列的一代測序技術，通過ITS序列擴增、測序比對，進一步鑒定真菌的種類，并進行聚類分析，分析真菌的群落結構及多樣性。[結果]從6個地黃品種的根際土壤中共分離出34株真菌，分別通過形態(tài)、顯微鑒定以及序列分析，最終歸屬于13屬27種，主要屬于青霉屬、毛霉屬、曲霉屬、根霉屬、酵母屬、枝孢屬、鏈格孢屬等。其中沁懷中分離出來的真菌屬于4屬，獅子頭3屬，金九3屬，金狀元4屬，噸王和北京3號均為5屬。[結論]不同地黃品種根際土壤中真菌的群落結構具有一定差異，地黃根系對其根際土壤中的真菌數量、組成和種類具有一定的塑造性。

關鍵詞 群落結構;真菌;地黃;根際土壤;土壤微生物

中圖分類號 S-154.3? 文獻標識碼 A? 文章編號 0517-6611（2021）11-0159-05

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.11.044

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Study on Fungal Community Structure of Rhizosphere Soil of Different Rehmannia glutinosa Species

WU Ting-juan，DU Quan，XIE Xiao-long

（Henan University of Chinese Medicine， Zhengzhou， Henan 450046）

Abstract [Objective]To study the differences in community structure and diversity of rhizosphere soil fungi in different Rehmannia glutinosa cultivars， and to determine whether there was a difference in the community structure and composition of fungi in different rhizosphere soils， and to provide a theoretical basis for revealing the formation mechanism of Rehmannia glutinosa continuous cropping obstacles.[Method]By adopting traditional plate culture and isolation methods， the fungi in the soils of six Rehmannia glutinosa cultivars of Dunwang， Beijing No. 3， Qinhuai， Jinjiu， Jinzhuangyuan and Shizitou were firstly purely cultured and separated by colony morphology. The observation and microscopic identification techniques were used for preliminary classification and enumeration; then the DNA of the initially isolated fungal strains was extracted， and the ITS sequence-based sequencing technology was used to further identify the fungal species by ITS sequence amplification and sequencing alignment. And carry out cluster analysis to analyze the community structure and diversity of fungi.[Result]A total of 34 fungi were isolated from the rhizosphere soil of 6 rehmannia cultivars. The morphological， microscopic identification and sequencing results were finally attributed to 27 genera and 13 species， mainly Penicillium， Mucor， Aspergillus and Root. Mildew， Saccharomyces， Cladosporium， Alternaria and the like. Among them， the fungi isolated from Qinhuai belonged to 4 genera， 3 heads of Shizitou， 3 genera of Jinjiu， 4 genera of Jinzhuangyuan， and 5 genera of Dunwang and Beijing No.3. [Conclusion] The community structure of fungi in the rhizosphere soil of different Rehmannia glutinosa varieties has certain differences， and the root system of Rehmannia glutinosa has a certain shaping of the number， composition and types of fungi in the rhizosphere soil.

Key words Community structure;Fungal;Rehmannia glutinosa;Rhizosphere soil;Soil microbe

根際土壤微生物是植物和土壤之間聯系的關鍵媒介，其對植物的生長發(fā)育起著關鍵的作用。植物根系通過向土壤中分泌一些物質來改變土壤理化環(huán)境，進而決定根際微生物的種類、數量和組成，從而導致土壤微生物群落發(fā)生改變。相反，根際微生物的群落結構、數量及其變化又會反饋影響植物的生長發(fā)育，會使植物的抗病能力下降，進一步加劇土傳病害的發(fā)生[1-2]。

地黃（Rehmannia glutinosa Libosch）為玄參科地黃屬多年生草本植物，在我國具有多年的栽培歷史，在各地都有種植。其中河南的產量大、質量佳，為傳統的道地藥材。地黃的連作障礙一直是限制地黃產量和品質的主要問題。研究表明，根際土壤微生物群落結構的改變導致土傳病害的增加是地黃產生連作障礙的主要原因之一[1]。王明道等[3]研究發(fā)現地黃連作后土壤中真菌的種類和數量發(fā)生顯著的變化。土壤真菌群落發(fā)生變化是導致地黃種植后引起重茬土壤中的真菌病害隨連作年限增長而增加的主要原因[3-4]。地黃種植過程中常見的真菌病害主要為枯萎病和根腐病，主要的致病菌為尖鐮刀菌[5]。研究表明，不同植物及同一植物不同品種間土壤微生物的群落結構有不同。在實際生產中，地黃栽培品種繁多，良莠不齊。因此，比較分析不同地黃品種間根際土壤微生物的群落結構的差異，可為評價不同地黃品種的抗病性和抗連作障礙性以及優(yōu)選抗逆性強的品種提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品的采集

此次試驗的土壤樣品采自河南省焦作市溫縣地黃種植基地。土壤樣品于2018年11月24日采集，共選擇北京3號、金狀元、金九、沁懷、獅子頭、噸王6個地黃品種的根際土壤。于每個地黃品種的根周圍20 cm范圍內用土鉆（直徑5 cm，高20 cm）采集0～20 cm的土層。每個品種隨機采集土壤樣品3份，共18份土樣。采集后土壤裝入無菌自封袋中，帶回實驗室并放于4 ℃冰箱中保存、備用。

1.2 土壤真菌群落結構的觀察

首先，采用稀釋涂布平板法來培養(yǎng)不同地黃品種根際土壤的真菌。稱取6個地黃品種的新鮮土壤樣品各5.0 g，加入已滅過菌的含有45 mL無菌水的三角瓶中。在4 ℃下200 r/min振蕩20 min，制成10-1的土壤稀釋液。靜置1 min后，吸取1.0 mL移入含有9.0 mL已滅菌的無菌水試管中，依次制成10-2、10-3，10-4一系列濃度梯度。然后吸取0.1 mL的懸浮液分別涂抹于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基上進行接種，每一稀釋濃度重復3次。將培養(yǎng)基倒置在28 ℃下培養(yǎng)3～5 d，挑取菌落反復純化。待長出單個菌落后計數，并通過形態(tài)觀察進行初步鑒定，隨后將菌轉移到PDA斜面試管中保存。

在真菌培養(yǎng)過程中觀察真菌的菌落形狀、大小、生長速度、顏色和菌落表面的紋飾，以及菌落質地、菌落高度、菌落邊緣形狀、有無滲出物等。將分離得到的菌株接種到PDA培養(yǎng)基上，在靠近菌0.5 min處插入在121 ℃滅菌20 min的載玻片，在28 ℃下培養(yǎng)3～5 d，待菌落長滿載玻片，隨后取下載玻片放置顯微鏡下觀察，對照《真菌鑒定手冊》和《中國真菌志》對菌株的形態(tài)特征進行初步鑒定。

其次，對分離到的單株采用新型植物基因組DNA提取試劑盒（NuClean Plant Genomic DNA Kit）來提取真菌菌株基因組DNA，具體操作按照其說明書進行。然后進行PCR擴增及測序。

1.3 數據統計分析

原始數據用Excel 2007進行整理分析。用SPSS 16.0對不同品種間的真菌菌落數量進行單因素方差統計分析，對不同稀釋倍數條件下的菌落數進行單因素方差分析。用MEGA 6.0軟件將獲得的株菌與獲取的同源性序列最高的菌株構建系統發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 不同地黃品種根際土壤的菌落數

從表1可以看出，金九、噸王、沁懷、北京3號、金狀元、獅子頭在10-2稀釋度中的菌落數顯著高于10-3稀釋度中的菌落數多（F=122.18，P<0.001）。在10-2稀釋度條件下，6個地黃品種間的真菌菌落數量差異顯著（F=5.46，P<0.01）;噸王的菌落數顯著高于金狀元、沁懷和獅子頭，而獅子頭和沁懷的菌落數低于其他品種;不同地黃品種根際土壤真菌的菌落數量平均值從大到小依次為噸王>北京3號>金九>金狀元>沁懷>獅子頭。在10-3稀釋度條件下，北京3號的真菌菌落數顯著高于其他品種，而其他品種間差異不顯著。

2.2 不同地黃品種根際真菌的群落特征分析

通過對6個地黃品種根際土壤的真菌形態(tài)特征和顯微特征進行觀察，共分離出34株真菌，主要分屬于13屬27種。其中沁懷中分離出來的真菌屬于4屬，獅子頭3屬，金九3屬，金狀元4屬，噸王和北京3號均為5屬。主要菌的特征如下：

（1）青霉菌。菌落為圓形，生長速度較快，表面為墨綠色，背面為黑色，周圍為白色表面平展或者具有皺紋，菌落為粉末狀，邊緣全緣，分生孢子為掃帚狀，孢子為圓形（圖1a）。

（2）黃曲霉菌。菌落為圓形，生長速度較快，表面為白色，有些中心為黃綠色，表面紋理疏松，菌落為絨毛狀，孢子為圓形，菌絲有隔（圖1b）。

（3）枝孢菌。菌落不規(guī)則，生長速度較慢，背面為黑色，表面皺縮，菌落為粉末狀，邊緣全緣，中間突起，孢子為紡錘形，菌絲隔狀（圖1c）。

（4）鏈格孢菌。菌落圓形，表面為灰黑色，背面為黑色，周圍有一圈乳黃色，菌落氈狀，表面平展，邊緣全緣，孢子紡錘形，棕色，孢子中有隔，30 μm左右（圖1d）。

（5）紅酵母菌。菌落小，圓形，生長速度慢，表面紅色，黏液狀，平展，邊緣全緣，孢子圓形，5 μm左右，無菌絲（圖1e）。

（6）米根霉菌。菌落圓形，生長速度較快，早期為白色，之后變成灰白色，菌絲無色，孢子梗直立，孢子為橢圓形或者圓形，大小不一（圖1f）。

（7）高山被孢霉菌。菌落圓形，中間為白色絨毛，邊緣一圈為半透明，表面疏松，沒有滲出物，孢子梗不分枝，孢子囊多孢屬，孢子小，8 μm左右，長形（圖1g）。

2.3 ITS序列的測序結果與分析

從真菌菌株DNA提取的瓊脂糖凝膠電泳結果（圖2）可以看出，不同地黃品種土壤中檢測到的條帶亮度和大小不同，可能是由于該試驗所用的提取方法對不同地黃品種根際土壤真菌的DNA提取量產生影響，也可能是因為菌株本身的差異性所造成的。另外，有一部分條帶出現拖尾現象，是因為在提取過程中部分DNA片段被降解造成的。

將提取的菌株DNA進行PCR擴增，擴增的DNA片段在500 bp左右。結果表明部分條帶沒有明顯的亮度，可能是因為提取的DNA量少（圖3）。

2.4 基于ITS基因序列的系統發(fā)育分析

將提取的34株真菌的TIS序列數據在NCBI上通過Blast進行核酸序列比對，再通過MEGA 6.0軟件將獲得的單個株菌與獲取的同源性序列最高的菌株構建系統發(fā)育樹。結果發(fā)現各菌株間相似性較高，其中1-4、1-6、3-3、4-1與2-3、5-6、2-4分屬于2支，相似性達到100%，通過構建系統發(fā)育樹這些菌株都屬于青霉屬（Penicillium）的不同菌株。根據以往的研究，青霉屬的物種特別多，迄今為止該屬包含354個物種，其中很多的物種在ITS基因序列上差異極小，相似性都為99%以上[6]。也就證實了1-4、1-6、3-3、4-1與2-3、5-6、2-4相似性達到100%，卻還分為2支。如3-6和已知菌株Penicillium aurantiogriseum KY552626相似性都為99%，1-4和Penicillium oxalicum MH282514.1相似性為94%。 3-7、3-2、4-4的相似性為100%，而 3-7和已知菌株Alternaria sp.JX418364的相似性為99%，可是他們又分為2支，應該是枝孢屬（Alternaria）的2個不同物種，有待進一步確定。3-1、5-7相似性也為100%。根據圖4可發(fā)現各菌株間相似性很高，所以與序列比對得到的菌株很難聚類，因此最終將相似性最高的幾株菌1-6、2-3、2-4、3-3、5-6去除，其余菌株和比對得到的同源性較高的序列構建系統發(fā)育樹。

從圖4可以看出，有9種菌株和已知菌株的同源性達到99%，分別為1-2和Aspergillus flavus MG575511.1（黃曲霉菌）、4-6和Aspergillus niger MG189963（黑曲霉菌）、3-6和Penicillium aurantiogriseum KY552626（青霉菌）、2-2和Talaromyces funiculosus MG744693.1、3-7和Alternaria sp.JX418364.1（鏈格孢菌）、4-5和Rhizopus oryzae KM249085.1（米根霉菌）、4-7和Mortierella alpina MG833809（高山被毛菌）、5-4和Rhodotorula paludigena KY104892（紅酵母菌）、3-8和Lectera colletotrichoides JQ647428。另外，3-1、5-1未確定分類菌種，有待進一步研究。 1-4和Penicillium oxalicum MH282514.1的ITS序列相似性為93%，為Penicillium（青霉屬）的一個潛在物種。3-8和4-4相似性為99%，而4-8與已知菌株Myrothecium roridum GQ351270.1（露濕漆斑菌）的相似性為17%，但需要進一步確認。上述結果說明地黃根際土壤中大多數菌株和系統發(fā)育親緣關系最密切的相關物種間存在很大差異，也說明純培養(yǎng)的真菌具有豐富的多樣性。

采用一代測序對挑選的34株菌進行測序分析，最終通過構建系統發(fā)育樹得到13屬27種真菌。其中北京3號土壤中主要有青霉菌、紅酵母菌、黃曲霉菌、露濕漆斑菌、淡紫紫孢菌（Purpureocillium lilacinum）共5種菌;金九土壤中主要有青霉菌、鏈格孢菌、淡紫紫孢菌共3種菌;沁懷土壤中主要為青霉菌、枝孢霉菌、籃狀菌屬（Talaromyces funiculosus）、Lectera colletotrichoides共4種菌;噸王土壤中主要為青霉菌、枝孢菌、Phoma novae-verbascicola、露濕漆斑菌、黃瓜萎蔫病菌（Plectosphaerella cucumerina）共5種菌;金狀元土壤中主要有高山被毛霉菌（Mortierella alpina）、米根霉菌（Rhizopus oryzae）、Phoma novae- verbascicola、黃瓜萎蔫病菌共4種菌;獅子頭土壤中主要有黑曲霉菌、枝孢霉菌、露濕漆斑菌共3種菌。與純培養(yǎng)試驗結果一致，北京3號、噸王、沁懷根際土壤中的真菌群落較豐富。在這6個地黃品種的根際土壤中，青霉屬分布在北京3號、沁懷、金九、噸王4個品種中;并且青霉屬的數量最多，共有7個種，屬于優(yōu)勢種，與純培養(yǎng)的結果一致。另外，通過分子鑒定發(fā)現Phoma novae-verbascicola、Myrothecium、Cladosporium、Plectosphaerella、Purpureocillium、Lectera 6個屬的物種，通過顯微和菌落形態(tài)不能鑒定出來。在傳統平板培養(yǎng)過程中，毛霉屬雖然只分離到高山被毛霉菌一種菌，但是毛霉屬也是土壤微生物中的優(yōu)勢物種[4]，與分子鑒定的結果一致。該試驗中分離到的黃曲霉菌、黑曲霉菌、黃瓜萎蔫病菌、露濕漆斑菌等是一些常見的真菌病原菌，其數量的變化可能是導致土壤中土傳病害發(fā)生的原因。

3 討論與結論

真菌是土壤微生物的重要組成部分，其群落結構的多樣性可評價其在土壤中生態(tài)功能的穩(wěn)定性。該試驗通過傳統培養(yǎng)方法和基于ITS序列的一代測序，對6種不同地黃品種的根際土壤中的真菌群落結構進行分析，結果發(fā)現10-2和10-3稀釋度為最適土壤稀釋濃度，10-2稀釋度中不僅分離的菌落數目多，而且具有豐富的物種多樣性。其中菌落數量均值從大到小依次為噸王>北京3號>金九>沁懷>金狀元>獅子頭。獅子頭的根際土壤中真菌菌落數相對較少，而金九、噸王、北京3號的根際土壤中真菌群落結構較豐富。僅從該試驗結果來看，同一植物的不同品種對土壤真菌的群落組成具有一定的塑造性。研究表明，種植不同棉花[7]、香蕉[8]品種造成土壤中真菌菌落的數量、豐度和多樣性均發(fā)生顯著變化。種植不同苧麻品種后土壤中細菌群落的結構和多樣性也發(fā)生顯著變化[6]。因此，不同地黃品種的根際土壤中真菌群落結構存在一定差異，將會影響土壤真菌病害的發(fā)生，進而對地黃的生長產生不同的反饋影響。根據不同地黃品種根際土壤真菌的致病性及群落結構多樣性的差異，可為優(yōu)選抗逆性強的地黃品種提供數據支撐。另外，種植地黃后造成的土壤微生物群落結構組成的改變是造成地黃連作障礙產生的原因之一[9-10]，該試驗結果可為探究不同地黃品種在抗連作障礙方面提供數據參考。

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