藥桑不同部位中1-脫氧野尻霉素的提取工藝優(yōu)化及含量測(cè)定分析

伊麗則熱?艾拜杜拉 陳冰婷 李德龍 譚惠文 馬曉麗

摘要 [目的]采用高效液相色譜-熒光法測(cè)定藥桑不同部位1-脫氧野尻霉素（1-DNJ）含量。[方法]用AQC為衍生試劑進(jìn)行衍生化反應(yīng)，流動(dòng)相為乙腈-乙酸銨（85∶15），流速1.0mL/min，進(jìn)樣量10 μL，最大激發(fā)波長(zhǎng)250 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為395 nm下進(jìn)行熒光檢測(cè);用正交試驗(yàn)考察最佳提取工藝條件。[結(jié)果]通過正交試驗(yàn)，得到最佳提取工藝為65%乙醇、料液比1∶150、超聲功率150 W、提取次數(shù)2次、超聲時(shí)間10 min，在最佳提取工藝下，桑葉、果實(shí)、桑枝中1-DNJ的含量分別是1.069%、0.341%、0.078%。[結(jié)論]高效液相色譜-熒光檢測(cè)法操作簡(jiǎn)便、靈敏度高、準(zhǔn)確可靠，可用于藥桑不同部位的1-DNJ含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞 藥桑;1-脫氧野尻霉素;提取工藝;優(yōu)化;含量測(cè)定;正交試驗(yàn);高效液相色譜-熒光檢測(cè)

中圖分類號(hào) R-284文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 0517-6611（2021）11-0178-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.11.048

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Optimization of Extraction Technology and Determination of 1-Deoxynotahirymycin in Different Parts of Mulberry

ABAYDULA Yilzera，CHEN Bing-ting，LI De-long et al

（College of Pharmacology，Xinjiang Medical University，Urumqi，Xinjiang 830011）

Abstract [Objective]To determine the content of 1-DNJ in different parts of mulberry by high performance liquid chromatography-fluorescence method.[Method]AQC was used as the derivative reagent to conduct the derivative reaction and generate the fluorescence product.The fluorescence detection was performed by HPLC at the maximum excitation wavelength of 250 nm and the maximum emission wavelength of 395 nm.The optimal mobile phase was ammonium acetonitrile acetate （85∶15），flow rate of 1.0 mL/min，and sample injection volume of 10 μL.Orthogonal experiment was used to investigate the optimal extraction process conditions.[Result]Through orthogonal experiment，the best extraction process was 65% ethanol，solid-liquid ratio 1∶150，ultrasonic power 150 W，extraction times 2 times，ultrasonic time 10 min.Under the best extraction process，the content of 1-DNJ in mulberry leaves，fruits，and mulberry branches was 1.069.%，0.341%，0.078%，respectively.[Conclusion]The high performance liquid chromatography-fluorescence detection method was simple，sensitive，accurate and reliable，and could be used for the determination of 1-DNJ content in different parts of mulberry.

Key words Mulberry;1-DNJ;Extraction process;Optimization;Content determination;Orthogonal test;High performance liquid chromatography-fluorescence detection

藥桑在植物分類學(xué)上屬黑桑種 （Morus nigra Linn.），是自然界極為罕見的稀貴桑樹半栽培半野生資源，也是我國唯一的黑桑種，栽培適應(yīng)地僅限于新疆[1]。目前已從桑樹植物中分離出十幾種多羥基生物堿，其中主要是1-脫氧野尻霉素（l-Deoxynojirimycin，1-DNJ），其是一種天然糖的結(jié)構(gòu)類似物[2]。1-DNJ是一種有效的α-糖苷酶抑制劑，具有多種藥理作用（如肥胖病、糖尿病、抗病毒感染），其在體內(nèi)停留時(shí)間較短，不需要肝臟代謝，無毒性積累及無代謝副產(chǎn)物，是目前桑資源綜合開發(fā)利用的重點(diǎn)[3-4]。

1-DNJ為典型的哌啶型生物堿，結(jié)構(gòu)中沒有苯環(huán)、雙鍵和羰基等發(fā)色團(tuán)，在紫外波長(zhǎng)范圍內(nèi)吸光度非常弱，無法直接用紫外檢測(cè)器檢測(cè)到;且結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)羥基，屬氮雜糖類，分子極性較大，普通方法進(jìn)行定性定量較困難。目前對(duì)桑葉、桑枝皮中的DNJ主要以乙醇溶液、酸液等為提取劑，通過常溫浸泡、加熱回流、超聲波等進(jìn)行提取[5-8]，并利用有機(jī)溶劑萃取、有機(jī)溶劑沉淀、離子交換、色譜層析和反相高效液相色譜法等方法進(jìn)行分離，1-DNJ 的含量測(cè)定則常采用HPLC-MS/MS、HPLC-ELSD、HPLC-UV 或 HPLC 柱前衍生化法[9-15]。該試驗(yàn)為研究藥桑不同部位中1-DNJ的最佳提取工藝和含量測(cè)定，以鹽酸為提取劑超聲提取，在提取過程中，由于不同的提取溶劑、提取料液比、提取次數(shù)、提取時(shí)間對(duì)藥桑中1-DNJ提取有一定影響，因此采用正交試驗(yàn)[16-17]考察最佳提取工藝條件，再用HPLC柱前衍生法結(jié)合熒光檢測(cè)法進(jìn)行含量測(cè)定，以期為新疆藥桑的藥用資源開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器。高效液相色譜儀（日本島津，LC-20AB泵，RF-20A熒光雙波長(zhǎng)檢測(cè)器，色譜柱phenomenexm，4.6 mm×250 mm，5 μm，Lcsolution色譜工作站）;高功率數(shù)控超聲波清洗器（KQ-500PE型，昆山市超聲儀器有限公司）;pH計(jì)（雷磁PHSJ-3F）;離心機(jī)（TOL-5A，上海菲恰爾分析儀器有限公司）;分析天平（BS110S）;渦旋儀（MS3BS25）。

1.1.2 試劑。1-脫氧野尻霉素（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)：MUST-11050502）;AQC衍生試劑（Waters公司）;甲醇（Fisher公司）;乙酸銨（分析純，天津市福晨化學(xué)試劑廠）;乙腈（Fisher公司）;乙醇、氨水（優(yōu)級(jí)純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所）;UPLC用水（MILLPORD）。

1.1.3 藥材。藥桑各藥用部位購買于新疆和田當(dāng)?shù)厮幉氖袌?chǎng)，均由新疆醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院徐海燕副教授鑒定。標(biāo)本存放于新疆醫(yī)科大學(xué)中心實(shí)驗(yàn)室。

1.2 方法

1.2.1 對(duì)照品貯備液的制備。精密稱取1-DNJ對(duì)照品5.00 mg 于5 mL容量瓶中，加入0.05 mol/L鹽酸溶液至刻度，搖勻得1 mg/mL的1-DNJ儲(chǔ)備液備用。

1.2.2 供試品溶液的制備。精密稱定藥桑果實(shí)、桑葉、桑枝3組樣品粉末，各2份，每份1.0 g，置于具塞錐形瓶中，通過設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，在不同試驗(yàn)條件下對(duì)藥桑不同部位的3組樣品進(jìn)行2次提取，將提取液經(jīng)減壓抽濾，合并2次濾液。水浴鍋蒸發(fā)濃縮至10 mL，置于4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 1-DNJ衍生化。取“1.2.2”項(xiàng)下樣品粗提取液10 μL于2 mL的離心管中，加80 μL Buffer，渦旋30 s，使樣品充分混勻于Buffer中，再加入10 μL AQC溶液，混勻后于室溫反應(yīng)5 min，用0.22 μm的一次性針頭過濾器過濾后，取10 μL進(jìn)樣分析。

1.2.4 最大吸收波長(zhǎng)的選擇。取對(duì)照品溶液1 mL，在200～800 nm紫外波長(zhǎng)內(nèi)掃描，繪制吸光度-波長(zhǎng)曲線，確定最大吸收波長(zhǎng)。

1.2.5 色譜條件優(yōu)化。取0.02 mol/L磷酸二氫鉀緩沖鹽-乙腈（85∶15，V/V）和乙腈-乙酸銨（85∶15、90∶10、95∶5）作為流動(dòng)相，最大激發(fā)波長(zhǎng)為 250 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為395 nm。流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。

1.2.6 專屬性試驗(yàn)。在確定的色譜條件下分析，采用三點(diǎn)法用PDA檢測(cè)圖中主峰的純度，提取峰前、峰尖和峰尾的紫外圖。取20 mg/mL藥桑樣品溶液各25 μL，按“1.2.5”優(yōu)化色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

1.2.7 方法學(xué)考察。

1.2.7.1 線性關(guān)系考察。精密吸取“1.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品貯備液適量，分別置于10mL容量瓶中，加0.05 mol/L鹽酸溶液稀釋至刻度，搖勻，得到0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、25.0、50.0 μg/mL的對(duì)照品溶液。精密吸取上述8種溶液各10 μL，衍生后，按“1.2.5”優(yōu)化色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。

1.2.7.2 精密度試驗(yàn)。取同一供試品溶液，在“1.2.5”色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣5次，測(cè)定吸光度的RSD值。

1.2.7.3 重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批樣品6份，按“1.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備法制備，并在“1.2.5”色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定吸光度的RSD值。

1.2.7.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。取料液比1∶150、超聲功率150 W、 提取次數(shù)2次、超聲時(shí)間10 min提取條件下的供試品溶液，在0、2、4、 8、12、24、48 h按“1.2.5”色譜條件分別進(jìn)樣測(cè)定。

1.2.7.5 加樣回收率試驗(yàn)。精密稱取已知含量的藥桑樣品粉末約0.1 g，共9份，分為3組，按低、中、高濃度分別加入1-DNJ對(duì)照品0.12、0.15、0.18 mg ，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，按“1.2.5”色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。

1.3 1-DNJ樣品提取的正交試驗(yàn)

1.3.1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。選擇影響1-DNJ提取效果各因素中有意義的水平做正交試驗(yàn)，對(duì)結(jié)果進(jìn)行極差分析，以確定最佳提取條件。選取以料液比（A）、超聲時(shí)間（B）、超聲功率（C）、提取次數(shù)（D）4個(gè)因素，每個(gè)因素選用3個(gè)水平，用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)。因素水平見表1。

1.3.2 驗(yàn)證試驗(yàn)。按上述最佳提取工藝條件進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，獲得最佳試驗(yàn)方案，在最佳試驗(yàn)方案條件下提取藥桑不同部位中1-DNJ含量。

1.4 最佳提取工藝條件下樣品含量測(cè)定 分別取不同樣品（果實(shí)、桑葉、桑枝，每個(gè)樣品取3份），按“1.3”項(xiàng)下最佳提取工藝條件，同“1.2.2”方法制備供試品溶液操作，并按“1.2.5”色譜條件進(jìn)行測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng) 在200～800 nm紫外波長(zhǎng)內(nèi)掃描，從吸光度-波長(zhǎng)曲線（圖1）可以看出，250 nm波長(zhǎng)處有最大吸收波長(zhǎng)。

2.2 色譜條件優(yōu)化 最終篩選的最佳色譜條件為乙腈-乙酸銨（90∶10）作為流動(dòng)相，最大激發(fā)波長(zhǎng)為 250 nm，最大發(fā)射波長(zhǎng)為 395 nm。流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量為10 μL。圖譜結(jié)果顯示（圖2），標(biāo)準(zhǔn)品和樣品在13 min時(shí)出峰，分離效果好。

2.3 專屬性試驗(yàn) 采用三點(diǎn)法用PDA檢測(cè)藥桑樣品圖中主峰的純度，提取峰前（半峰高處）、峰尖和峰后（半峰高處）的紫外光譜圖（圖3）。圖譜結(jié)果顯示峰前、峰尖和峰尾提取的紫外圖一致，由此可知在上述色譜條件下，1-DNJ峰形良好，與其他化學(xué)成分及雜質(zhì)能有效分離（分離度大于1.5）。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察。按“1.2.7.1”操作，計(jì)算得出線性回歸方程Y=52 439X+51 419（r=0.999 9）。試驗(yàn)結(jié)果表明，1-DNJ對(duì)照品溶液濃度在0.5～50.0μg/mL線性關(guān)系良好。

2.4.2 精密度試驗(yàn)。按“1.2.7.2”操作，計(jì)算出吸光度的RSD為1.51%（n=6），表明精密度試驗(yàn)符合要求。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn)。按“1.2.7.3”操作，計(jì)算出吸光度的RSD為1.51%（n=6），表明該方法重復(fù)性好。

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.2.7.4”操作，結(jié)果發(fā)現(xiàn)48 h內(nèi)1-DNJ色譜峰面積無明顯變化，RSD為1.70%，表明被測(cè)樣品在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn)。按“1.2.7.5”操作，藥桑樣品液加樣回收率結(jié)果見表2，結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確、可靠，適用于1-DNJ成分的測(cè)定。

2.5 正交試驗(yàn) 由表3可知，影響1-DNJ提取率的因素主次順序?yàn)锳>C>D>B，即料液比的影響最大，其次是超聲功率、提取次數(shù)，超聲時(shí)間的影響最小。1-DNJ最佳提取工藝條件為A3B1C2D2，即料液比1∶150，超聲時(shí)間10 min，提取次數(shù)2次，超聲功率150 W。

按上述最佳提取工藝條件A3B1C2D2進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，由驗(yàn)證結(jié)果可知，按最佳工藝條件，即料液比1∶150、超聲功率150 W、提取次數(shù)2次、超聲時(shí)間10 min，提取得到的1-DNJ含量均高于其他各正交試驗(yàn)值，同時(shí)其RSD為1.46%，說明此工藝條件穩(wěn)定、可行。

2.6 樣品含量測(cè)定 由表4可知，藥桑果實(shí)、桑葉、桑枝中1-DNJ平均含量分別為0.341%、 1.069%、0.078%。

3 討論與結(jié)論

由于1-DNJ是一種不帶發(fā)色基團(tuán)的小分子含氮化合物，在紫外和可見光波段內(nèi)無吸收峰，不能直接用HPLC-熒光法進(jìn)行檢測(cè)分析。文獻(xiàn)中大多采用9-芴甲氧羥基（FMOC）衍生，該衍生試劑有毒，且DNJ-FMOC絡(luò)合物在室溫非酸性條件下不穩(wěn)定，半衰期僅有3 d，因此該試驗(yàn)以AQC為衍化試劑，在一定的條件下1-DNJ與AQC反應(yīng)可以生成DNJ-AQC絡(luò)合物，該物質(zhì)是一種熒光物質(zhì)，可以產(chǎn)生熒光吸收，通過紫外光譜可知該衍生反應(yīng)迅速，衍生產(chǎn)物穩(wěn)定。該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高且目標(biāo)色譜峰分離效果好，峰面積與1-DNJ濃度呈極顯著正相關(guān)，從精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、回收率的測(cè)定結(jié)果來看，該方法是穩(wěn)定可靠的，靈敏度完全可以滿足一般藥桑、桑葉粉中1-DNJ測(cè)定的要求。因此，該方法可作為測(cè)定桑葉中1-DNJ含量的有效方法。

植物有效成分的提取分離是一個(gè)非常復(fù)雜的傳遞過程，影響因素眾多，提取溶劑是其中之一。1-DNJ屬于生物堿，能溶于水、酸、乙醇中。該試驗(yàn)選擇65%乙醇作為提取溶劑，再根據(jù)正交試驗(yàn)，最終得到最佳提取工藝：稱取樣品粉末1.0 g，置于具塞錐形瓶，加15 mL 65%乙醇，密塞，稱重，置超聲波清洗儀中超聲提取10 min，功率150 W，離心（5 000 r/min，離心10 min），將濾渣進(jìn)行二次提取，條件同第1次，合并2次濾液，冷卻至室溫，再稱定重量，補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過0.22 μm微孔濾膜。在此條件下分別提取藥桑果實(shí)、桑葉、桑枝，在最佳色譜條件下進(jìn)行含量測(cè)定。

在選定的最佳提取工藝結(jié)合HPLC-熒光檢測(cè)條件下進(jìn)行藥桑果實(shí)、桑葉和桑枝中1-DNJ 的含量測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，藥桑果實(shí)、桑葉、桑枝中的1-DNJ含量分別為0.341%、1.069%、0.078%，表明藥桑果實(shí)中1-DNJ含量最豐富，其次是桑葉，桑枝本身不易粉碎影響1-DNJ的提取。該試驗(yàn)設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)方案，對(duì)各種提取影響因素綜合考察，采用HPLC-熒光檢測(cè)法進(jìn)行含量測(cè)定并進(jìn)行方法學(xué)試驗(yàn)考察該方法的可靠性，該方法操作方便、靈敏度高、專屬性強(qiáng)，可適用于藥桑不同部位中1-DNJ含量測(cè)定。

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