衍生化串聯(lián)質(zhì)譜檢測55種酰基肉堿方法的建立及其臨床應(yīng)用*

丁 麗，樊 新，張 瑞

空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科，陜西西安 710032

有機酸代謝病和脂肪酸氧化代謝病均屬于常染色體隱性遺傳病，是常見的遺傳代謝病，在新生兒和成人中均可發(fā)病，臨床表現(xiàn)無特異性，主要表現(xiàn)為肝病、心肌病及肌肉疾病等[1-3]。雖然許多種類的遺傳代謝病目前已有相應(yīng)的有效治療方法，但是病死率和多種后遺癥發(fā)生率的降低都依賴于早期的快速診斷和及時的干預(yù)治療[4-6]。在過去，遺傳代謝病的診斷和治療大多數(shù)依賴于醫(yī)生的臨床經(jīng)驗和一些非特異性的生化指標(biāo)檢測。近年來，隨著臨床診斷學(xué)的不斷發(fā)展，這種局面已經(jīng)改觀。其中，串聯(lián)質(zhì)譜分析技術(shù)在臨床診斷，尤其是遺傳代謝病篩查中的作用不容忽視[7-9]，自1989年MILLINGTON等[10]首次將串聯(lián)質(zhì)譜用于新生兒篩查以來，該項技術(shù)迅速發(fā)展，在遺傳代謝病篩查中的作用越來越重要。但是目前常用的串聯(lián)質(zhì)譜法只能檢測31種酰基肉堿[11-13]，擴大酰基肉堿的檢測種類將為臨床相關(guān)疾病的診斷提供更多可能性，本研究利用衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法檢測了55種酰基肉堿，考察了該檢測方法的各種影響因素，并運用該方法對西部地區(qū)嬰幼兒進(jìn)行篩查診斷，以期為我國新生兒篩查項目的發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料來源 2014年5月至2016年1月采集來自西部地區(qū)自愿選擇串聯(lián)質(zhì)譜篩查的嬰幼兒標(biāo)本2 869例，新生兒組入選標(biāo)準(zhǔn)為出生后3～28 d健康的新生兒，男999例,女927例；兒童組入選標(biāo)準(zhǔn)為28 d至1歲的健康嬰幼兒，男490例，女453例。本項目已通過空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批。

1.2標(biāo)本收集與保存 兒童組：研究對象在上午7～9時采集空腹末梢血滴于專用采血濾紙上，形成幾個均勻血斑，完全滲透，待自然晾干后，封于塑料袋內(nèi)，-20 ℃冰箱保存待檢。新生兒組：新生兒出生3 d后，哺乳多次，采足跟血于空白采血濾紙上，完全滲透，待自然晾干后，封于塑料袋內(nèi)，-20 ℃冰箱保存待檢。

1.3儀器與試劑 API3200型串聯(lián)質(zhì)譜儀購自美國AB生物應(yīng)用系統(tǒng)公司，高效液相色譜儀采用美國安捷侖公司產(chǎn)品(Agilent 1200)，96孔板加熱吹干裝置購于杭州奧盛公司(MD200)。

甲醇、正丁醇、乙酰氯、乙腈等試劑購于美國Fisher公司，均為色譜級。將正丁醇和乙酰氯按體積比9∶1配制成3 mol/L的鹽酸正丁醇溶液作為衍生化試劑備用，96孔聚丙烯板購于北京博奧生物集團有限公司。實驗中所用氮氣的純度為99.9%以上。

酰基肉堿內(nèi)標(biāo)有8種：游離肉堿內(nèi)標(biāo)(d9-C0)、乙酰肉堿內(nèi)標(biāo)(d3-C2)、丙酰肉堿內(nèi)標(biāo)(d3-C3)、丁酰肉堿內(nèi)標(biāo)(d3-C4)、異戊酰肉堿內(nèi)標(biāo)(d9-C5)、辛酰肉堿內(nèi)標(biāo)(d3-C8)、十四酰肉堿內(nèi)標(biāo)(d9-C14)、十六酰肉堿內(nèi)標(biāo)(d3-C16)，上述同位素內(nèi)標(biāo)用甲醇稀釋成萃取液，4 ℃冰箱保存，1個月內(nèi)用完。

1.4檢測指標(biāo) 檢測健康嬰幼兒血中55種肉堿：游離肉堿(C0)、乙酰肉堿(C2)、丙酰肉堿(C3)、丁酰肉堿(C4)、異戊酰肉堿(C5)、己酰肉堿(C6)、庚酰肉堿(C7)、辛酰肉堿(C8)、壬酰肉堿(C9)、癸酰肉堿(C10)、十二酰肉堿(C12)、十四酰肉堿(C14)、十六酰肉堿(C16)、十七酰肉堿(C17)、十八酰肉堿(C18)、二十碳酰肉堿(C20)、二十二碳酰肉堿(C22)、二十四碳酰肉堿(C24)、二十五碳酰肉堿(C25)、二十六碳酰肉堿(C26)、甲基巴豆酰肉堿(C5:1)、辛烯酰肉堿(C8:1)、癸烯酰肉堿(C10:1)、癸二烯酰肉堿(C10:2)、癸三烯酰肉堿(C10:3)、十二烯酰肉堿(C12:1)、十四烯酰肉堿(C14:1)、十四碳二烯酰肉堿(C14:2)、十六烯酰肉堿(C16:1)、十八烯酰肉堿(C18:1)、十八碳二烯酰肉堿(C18:2)、二十碳烯酰肉堿(C20:1)、二十碳二烯酰肉堿(C20:2)、二十碳三烯酰肉堿(C20:3)、丙二酰肉堿(C3DC)、甲基丙二酰肉堿(C4DC)、戊二酰肉堿(C5DC)、己二酰肉堿(C6DC)、辛二酰肉堿(C8DC)、癸二酰肉堿(C10DC)、十二碳二酰肉堿(C12DC)、十四碳二酰肉堿(C14DC)、十六碳二酰肉堿(C16DC)、十八碳二酰肉堿(C18DC)、二十碳二酰肉堿(C20DC)、羥基丁酰肉堿(C4-OH)、羥基異戊酰肉堿(C5-OH)、羥基己酰肉堿(C6-OH)、羥基十二酰肉堿(C12-OH)、羥基十四酰肉堿(C14-OH)、羥基十六烯酰肉堿(C16:1-OH)、羥基十六酰肉堿(C16-OH)、羥基十八烯酰肉堿(C18:1-OH)、羥基十八酰肉堿(C18-OH)、羥基二十酰肉堿(C20-OH)水平，確定本實驗室的參考值范圍。

1.5方法

1.5.1樣品處理方法 用打孔器在干血片上取直徑3 mm的圓形血片(4個質(zhì)控，一個空白)，置于96孔板中，每孔加入1.3中制備的萃取液100 μL，室溫密封振蕩15 min萃取血片中的22種氨基酸，轉(zhuǎn)移萃取液至另一個96孔聚丙烯板，40 ℃加熱氮氣吹干，再加入60 μL 1.3中制備的衍生化試劑，eflon膜覆蓋，置于65 ℃恒溫箱內(nèi)反應(yīng)20 min，隨后40 ℃氮氣吹干，再加入80%乙腈100 μL溶解，鋁膜覆蓋，串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測。

1.5.2儀器設(shè)置狀態(tài) 乙腈作為流動相，設(shè)置液相色譜的流速為300 μL/min，進(jìn)樣量為20 μL，每次測定酰基肉堿采用母離子掃描，子離子質(zhì)荷比(m/z)為85 Da片段，掃描范圍為m/z 210～502，一個樣品測試需時間約2 min。

1.5.3資料分析 定量分析采用軟件ChemoView 2.0.2版本(美國AB生物應(yīng)用系統(tǒng)公司)，根據(jù)經(jīng)過衍生化的同位素內(nèi)標(biāo)和各種酰基肉堿的離子峰強度，計算出所測標(biāo)本中55種酰基肉堿的水平。

1.6影響因素的考察 分別考察抗凝劑使用、標(biāo)本的保存時間、不同氮氣吹干時間、內(nèi)標(biāo)液保存時間對測定結(jié)果的影響。

1.6.1抗凝劑使用對測定結(jié)果的影響 為了考察抗凝劑使用對測定結(jié)果的影響，將無抗凝劑的標(biāo)本結(jié)果與含有乙二胺四乙酸(EDTA)及肝素標(biāo)本的結(jié)果比較。直接采末梢血滴于干濾紙片上制備無抗凝劑的標(biāo)本，采靜脈血于含有EDTA的真空管混勻后滴于干濾紙片上制備含有EDTA的標(biāo)本，采靜脈血于含有肝素抗凝劑的真空管混勻后滴于干濾紙片上制備含有肝素抗凝劑的標(biāo)本。

1.6.2標(biāo)本的保存時間對測定結(jié)果的影響 通過比較將標(biāo)本自然晾干后放置1 d的結(jié)果與自然晾干后放置7、14、21、28、35 d后進(jìn)行檢測的結(jié)果來考察過長的保存時間是否對本方法的測定結(jié)果有影響。

1.6.3不同氮氣吹干時間對測定結(jié)果的影響 由于人體內(nèi)酰基肉堿檢測相對水平較低且性質(zhì)不穩(wěn)定，因此55種酰基肉堿是否可以完全衍生化，依賴于標(biāo)本的前期處理。水的存在會直接影響衍生化，不同氮氣吹干時間會影響標(biāo)本中是否有水的存在從而影響衍生化過程，為此筆者考察了不同氮氣吹干時間對實驗結(jié)果的影響，比較了50 ℃，0.2 MPa氮氣吹干條件下氮氣吹干10、15、20 min對實驗結(jié)果的影響。

1.6.4內(nèi)標(biāo)液保存時間與測定結(jié)果的影響 為了考察內(nèi)標(biāo)液的穩(wěn)定性，筆者選擇內(nèi)標(biāo)液于4 ℃保存1、7、14、21、28、42、56 d后進(jìn)行檢測，根據(jù)目標(biāo)化合物的平均值和相對于第1天的偏差來比較保存時間對結(jié)果的影響。

1.7線性范圍考察 采用本實驗室建立的衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法在上述優(yōu)化條件下對2014年5月至2016年1月2 869例西部地區(qū)出生的3 d至1歲健康嬰幼兒全血標(biāo)本進(jìn)行55種酰基肉堿檢測，初步建立本實驗室衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法檢測55種酰基肉堿的線性范圍。

1.8方法精密度考察 根據(jù)批內(nèi)變異系數(shù)及批間變異系數(shù)來考察本方法的精密度，同一標(biāo)本，平行分為20組，一天內(nèi)采用本方法同時進(jìn)行標(biāo)本前處理并檢測，得到批內(nèi)精密度。之后20 d內(nèi)重復(fù)上述實驗，得到批間精密度。

2 結(jié) 果

2.1抗凝劑使用對測定結(jié)果的影響 EDTA可使檢測結(jié)果降低，肝素抗凝劑會使部分結(jié)果升高，故臨床標(biāo)本采集不宜使用抗凝血。使用新鮮末梢血制成的干血片可以用于酰基肉堿項目檢測。因篇幅有限，僅列出C0、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10檢測結(jié)果，見表1。

表1 抗凝劑對肉堿檢測結(jié)果的影響

2.2標(biāo)本的保存時間對測定結(jié)果的影響 長鏈肉堿水平隨著標(biāo)本保存時間的延長而降低，建議標(biāo)本在4 ℃保存14 d以內(nèi)完成檢測。因篇幅有限，僅列出C0、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10檢測結(jié)果，見表2。

表2 標(biāo)本保存時間對肉堿檢測結(jié)果的影響

續(xù)表2 標(biāo)本保存時間對肉堿檢測結(jié)果的影響

2.3不同氮氣吹干時間對測定結(jié)果的影響 吹干10 min肉堿水平普遍偏低，吹干20 min肉堿個別指標(biāo)偏移較大，吹干15 min肉堿指標(biāo)均較理想。因篇幅有限，僅列出C0、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10檢測結(jié)果，見表3。

表3 不同氮氣吹干時間對肉堿檢測的影響

2.4內(nèi)標(biāo)液保存時間與測定結(jié)果的影響 同位素內(nèi)標(biāo)復(fù)溶后會逐漸分解或衰減，致使標(biāo)準(zhǔn)降低，檢測結(jié)果增高，相比于第1天的測定結(jié)果，經(jīng)過28 d左右個別指標(biāo)變化就達(dá)到10%，建議同位素內(nèi)標(biāo)復(fù)溶后盡快使用，4 ℃冰箱保存效期為28 d左右。因篇幅有限，僅列出C0、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10檢測結(jié)果，見表4。

表4 內(nèi)標(biāo)液保存時間與肉堿檢測結(jié)果的關(guān)系[μmol/L或μmol/L(%)]

2.5本方法精密度的考察 經(jīng)過測量本方法55種酰基肉堿的批內(nèi)變異系數(shù)為7.3%～9.9%，批間變異系數(shù)為11.3%～13.9%。

2.655種酰基肉堿的實驗室參考范圍 兒童全血9種酰基肉堿(C0、C2、C3、C4、C5、C6、C16、C18、C5DC)的參考區(qū)間隨年齡的不同而異。與兒童組的各酰基肉堿參考區(qū)間比較發(fā)現(xiàn)，新生兒組C0低于兒童組；新生兒組C2、C3、C4、C5、C6、C16、C18、C5DC高于兒童組；新生兒組C8、C10、C14、C5-OH與兒童組相近。采用本實驗室建立的串聯(lián)質(zhì)譜法檢測健康嬰幼兒全血中55種酰基肉堿的健康人群參考范圍見表5。

表5 衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法檢測55種酰基肉堿的參考值范圍(μmol/L)

3 討 論

液相串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)主要是將被測物質(zhì)分子電離成各種m/z不同的帶電粒子，應(yīng)用電磁學(xué)原理使粒子產(chǎn)生分離排列，通過測定離子峰的強度，獲得確定化合物的相對分子質(zhì)量、分子式[14-16]。該技術(shù)能在2～3 min內(nèi)對一份標(biāo)本進(jìn)行幾十種代謝產(chǎn)物分析，而通過對這些產(chǎn)物的分析，可以對30余種遺傳性代謝病，包括有機酸代謝紊亂和脂肪酸代謝紊亂性疾病進(jìn)行篩查和診斷[17-21]。

本研究結(jié)果表明，標(biāo)本處理過程的最佳條件為：使用新鮮末梢血或肝素抗凝血制成的干血片于4 ℃保存標(biāo)本，14 d以內(nèi)完成檢測，氮氣吹干15 min，同位素內(nèi)標(biāo)復(fù)溶后盡快使用，4 ℃冰箱保存效期為28 d左右。本研究還根據(jù)優(yōu)化的衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法建立了本實驗室的55種酰基肉堿的參考值范圍。本實驗室建立的衍生化串聯(lián)質(zhì)譜法具有快速、準(zhǔn)確、特異的特點。此外，本研究還表明，兒童全血9種酰基肉堿的參考區(qū)間隨年齡的不同而異。與兒童的各酰基肉堿參考區(qū)間比較發(fā)現(xiàn)，新生兒C0低于兒童；新生兒C2、C3、C4、C5、C6、C16、C18、C5DC高于兒童；新生兒C8、C10、C14、C5-OH與兒童相近。一方面可能是由于新生兒的肝、腎等重要臟器尚未發(fā)育成熟，在酰基肉堿的代謝方面可能明顯不同于兒童；另一方面可能是由于新生兒的飲食主要為母乳或者奶粉，來源比較單一，而兒童的食物來源比較豐富，因此這兩個群體之間酰基肉堿的攝入和利用存在明顯不同，導(dǎo)致酰基肉堿的分布出現(xiàn)明顯差異。

本文建立的衍生化質(zhì)譜法可以測定更多的酰基肉堿，檢測種類的增加為今后新生兒遺傳代謝病的篩查乃至其他病種的臨床研究和治療提供了更多的可能性。兒科醫(yī)生尤其是新生兒科醫(yī)生應(yīng)重視利用衍生化串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行遺傳代謝病檢測，以達(dá)到早診斷、早治療的目的。