不同診斷方法對消化內科幽門螺桿菌感染的診斷價值

袁世梅,楊 偉,魏進武,廖俐雅,余登瓊,左崇宇,余曉輝,宋 仁,熊中政

重慶市墊江縣人民醫院檢驗科，重慶 408300

幽門螺桿菌最初于消化性潰瘍和慢性胃炎患者胃黏膜中發現，是一種微需氧的革蘭陰性菌。通過親密接觸、口-口和糞-口等途徑傳播，幽門螺桿菌已成為全球感染范圍最廣的細菌之一[1]。近年來大量研究證明，除消化性潰瘍和慢性胃炎外，幽門螺桿菌感染還與胃部腫瘤的發生關系密切[2]。此外，神經系統、心血管系統及皮膚、眼科等非消化系統疾病的發生、發展進程中也可見幽門螺桿菌的介導作用[3-4]。因此，積極治療幽門螺桿菌感染對保護患者身體健康具有重要意義。幽門螺桿菌感染的準確診斷是治療的先決條件，目前臨床幽門螺旋菌感染的診斷常采用14C尿素呼氣試驗、內鏡及血清學檢查，但這幾種方法檢測的準確性尚達不到臨床預期。細菌培養雖準確性較高，但檢查周期長。故本研究擬對疑似幽門螺旋菌感染患者采用實時熒光定量PCR檢測，以探究是否能為臨床篩查提供優化方案。

1 資料與方法

1.1一般資料 回顧性選擇重慶市墊江縣人民醫院2018年9月至2020年5月收治的臨床表現為上消化道癥狀患者197例，其中男103例，女94例；年齡23～64歲。納入標準：(1)有不同程度的反酸、噯氣、用餐后腹痛腹脹等消化道癥狀；(2)接受內鏡胃活組織檢查；(3)能明白醫生指令配合完成檢查。排除標準：(1)合并內鏡檢查禁忌證；(2)肝、膽及胰腺疾病確診；(3)合并胃癌或其他惡性腫瘤；(4)入組前2周內有抗菌藥物、抑酸劑、抗凝劑用藥史。本研究符合重慶市墊江縣人民醫院醫學倫理委員會相關規定并獲得開展批準，所有受試者及家屬對研究流程充分了解并自愿簽署知情同意書。

1.2檢驗及判斷方法

1.2.1內鏡檢查 受試者受檢前6 h禁食，2 h禁水，給予受試者去泡劑(四川省自貢鴻鶴制藥有限公司)口服，若受試者有需求且無麻醉禁忌證，在其自愿簽署麻醉告知書后可給予無痛內鏡檢查。所有受試者由具有獨立操作資質的同級別內鏡醫生進行檢查，采用電子放大內鏡結合LUCERA CLV-260內鏡系統(OLYMPUS公司)進行檢測。參照內鏡檢查標準，打開聯動成像模式將內視鏡經食道放至胃竇，再緩慢退鏡依次觀察胃竇胃體交界處、胃體、胃角和胃底。取受試者胃部發紅部位及發黃部位胃黏膜組織，若無明顯發紅部位則只取一個部位的標本，每例受試者標本分為兩份，妥善封存。借助Pipette取色軟件測量每例受試者所有取樣周圍5 cm直徑圓圈內R、G、B值，再根據所得的均值計算R/(G+B)，當R/(G+B)≥0.967提示幽門螺桿菌感染陽性[5]。

1.2.214C尿素呼氣試驗 受試者受檢前2 h禁食，取一粒14C尿素膠囊(深圳市中核海得威生物科技有限公司，批準文號：國藥準字H20068129，規格：2.78×10-2MBq(0.75×10-3MCi)/粒×40粒)，受試者溫水送服，靜坐0.5 h后取一加蓋樣品管收集受試者呼氣標本，待樣品管中捕集液由紫色變為無色提示標本收集完成。采用幽門螺桿菌測試儀(深圳海得威公司，型號：HUBT-20P)檢測呼氣樣本中每1 mol二氧化碳每分鐘衰變指數，當衰變指數≥50，則判斷為幽門螺桿菌感染陽性[6]。

1.2.3血清學檢測 抽取受試者靜脈血4 mL，采用離心機(湖南長沙湘儀離心機儀器有限公司，型號：L535)分離血清，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測幽門螺桿菌IgG抗體，試劑盒購于美國PBM公司。當IgG抗體滴度≥20 U/mL提示幽門螺桿菌感染陽性[7]。

1.2.4實時熒光定量PCR檢測 將受試者胃黏膜組織充分剪碎、研磨，采用RNA提取試劑盒提取標本中的總RNA，加入引物，引物序列：上游5′-TCTGTCGCAAGCTGGCATCGT-3′,下游5′-TCCATAACATGCTCTCATCAT-3′。依次經預變性(94 ℃，3 min)、變性(90 ℃，1 min)、退火(65 ℃，1 min)、延伸(68 ℃，1.5 min)處理，重復退火及延伸操作39次以增加產物量。以GAPDH作為內參，采用2-ΔΔCt法計算幽門螺桿菌DNA相對表達水平。

1.2.5細菌培養 將受試者胃黏膜組織接種至哥倫比亞血培養基。將培養基置于微需氧環境中恒溫(37 ℃)培養，4 d后觀察菌落形態。幽門螺桿菌感染陽性表現為：菌落呈細小針尖樣，部分融合成片，無色透明，表面濕潤且光滑。采用革蘭染液對菌落染色，油鏡下鏡檢幽門螺桿菌感染陽性表現為：顏色呈紅色，形狀呈典型海鶴狀或弧形。本研究將細菌培養結果作為檢測幽門螺桿菌感染的“金標準”。

1.3統計學處理 采用SPSS23.0軟件進行數據處理及統計分析。計數資料采用頻數或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗；采用受試者工作特征(ROC)曲線對幾種方法的檢驗效能進行分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1“金標準”檢驗結果 細菌培養結果顯示，幽門螺桿菌感染陽性受試者129例，陰性68例，陽性率為65.48%。

2.2各方法診斷幽門螺桿菌感染的ROC曲線分析 內鏡檢查、14C尿素呼氣試驗、血清學檢查、實時熒光定量PCR檢測幽門螺桿菌感染的ROC曲線下面積依次為0.756、0.838、0.939與0.985，其中PCR的曲線下面積最大。見表1、圖1。

表1 不同檢驗方法對幽門螺桿菌檢驗效能比較

圖1 各方法檢測幽門螺桿菌感染效能的ROC曲線分析

2.3各方法檢驗結果與“金標準”檢驗結果比較 內鏡檢查、14C尿素呼氣試驗、血清學檢查、實時熒光定量PCR檢測幽門螺桿菌感染的靈敏度依次為72.87%、88.37%、90.69%、94.57%，特異度依次為69.12%、72.06%、85.29%、95.59%，準確率依次為71.57%、82.74%、88.83%、94.92%，其中實時熒光定量PCR檢測的準確率明顯高于內鏡檢查、14C尿素呼氣試驗及血清學檢查，差異均有統計學意義(χ2=38.512、14.737、4.898,P<0.05)。見表2。

表2 不同檢驗方法與細菌培養檢測結果對比

3 討 論

幽門螺桿菌是最常見的病原菌之一，全球約一半的人口為其感染者。流行病學顯示，亞洲人群中幽門螺桿菌感染率明顯高于歐美人群，這可能與亞洲家族聚居習慣及幽門螺桿菌傳染方式有關。我國幽門螺桿菌感染人口呈逐年上升趨勢[8]。全球多個研究中心均證實，幽門螺桿菌感染與消化道疾病密切相關，近年來證實，神經、血液、心血管系統疾病的發生與幽門螺桿菌感染有關[4-9]。準確診斷幽門螺桿菌感染，對后期治療及抑制感染的傳播具有積極意義。

目前，臨床診斷幽門螺桿菌感染的常用方法有細菌培養、內鏡檢查、血清學試驗及14C尿素呼氣試驗等，前二者屬于侵入性檢測，后二者屬于非侵入性檢測。內鏡檢測是指將帶有鏡頭的軟管經咽喉置入胃中，該方法可直接觀測到胃部黏膜狀態，并根據黏膜是否異常紅腫這一征象，間接判斷是否有幽門螺桿菌感染[10]。該方法可較快速得出結論，但對于部分受檢者較痛苦，且胃部情況觀察及結果判斷受操作醫生主觀影響較大，檢查靈敏度及特異度較低。細菌培養是將受試者胃黏膜標本置于微氧恒溫的營養培養基中以模擬其在胃內的生存環境，根據培養菌落的外形特點及革蘭染色結果對幽門螺桿菌感染情況進行判斷。細菌培養靈敏度及準確度均可達到95%以上[11]。且細菌培養可用于藥敏檢測，對臨床合理選擇抗菌藥物提供依據[12]。但細菌培養時間周期較長，檢測過程中可能因標本質量不佳、受其他雜菌污染、運輸及儲存不當而影響檢測結果。本研究采用的血清學檢測方法為ELISA法，通過既有特定試劑盒對受試者血清中的幽門螺桿菌抗體進行檢測，操作較簡便；但血清學抗體檢驗不能區分既往感染和現癥感染，故其在臨床中的應用受到一定限制[13]。14C尿素呼氣試驗憑借其操作簡便、結果可靠度較高等特點，成為臨床應用最廣泛的幽門螺桿菌感染檢測方法之一。其操作過程對受試者而言痛苦較小，但檢測過程中口服的14C膠囊具有放射性，對幼兒、孕婦及有懷孕計劃的育齡期受試者并不適用[14]。

實時熒光定量PCR技術以熒光物質作為標記，在DNA擴增過程中檢測每次PCR循環后目的DNA的表達量，并通過特定內參定量分析[15]。目前，實時熒光定量PCR在臨床已被廣泛應用，在肝炎、獲得性免疫缺陷綜合征、禽流感等感染性疾病，地中海貧血等遺傳疾病，腫瘤診斷及胎兒排畸過程中均有重要意義[16-17]。故而本研究采用實時熒光定量PCR法檢測幽門螺桿菌感染情況。本研究結果顯示，納入的197例具有上消化道癥狀的受試者有129例細菌培養呈陽性，陽性率為65.48%。以細菌培養結果作為“金標準”，將內鏡檢測、14C尿素呼氣試驗、血清學檢測及實時熒光定量PCR檢測結果進行ROC曲線分析，得出實時熒光定量PCR檢測的AUC面積最大，為0.985。說明其檢測幽門螺桿菌感染的效能較高。且實時熒光定量PCR檢測準確率、靈敏度及特異度分別為94.92%、94.57%與95.59%，進一步說明其檢測幽門螺桿菌感染的效能較高。且本研究發現，實時熒光定量PCR檢測時間較短，相對于細菌培養標本要求限制更少，新鮮標本及石蠟包埋樣本均可進行檢測。

綜上所述，實時熒光定量PCR檢測診斷幽門螺桿菌的準確性及靈敏度較高，有望為臨床幽門螺桿菌感染篩查提供新思路。但本研究納入標本較少，后期應進一步擴大標本量以獲得更準確的結果。