貴定云霧茶本地種和引進種次生代謝產物差異分析

王春波，呂 輝，韋玲冬，郭治友

（黔南民族師范學院生物科學與農學院，貴州都勻 558000）

茶（Camellia sinensis（L.）O.Ktze）是世界上僅次于水的第二受歡迎的飲料，茶樹作為一種重要的經濟作物，已在50 多個國家和地區被廣泛種植[1]。茶的質量主要通過香氣、風味和外觀等感官特性來評估，受多種因素的影響，包括遺傳背景、生長環境、收獲季節、葉片分選、加工和貯藏等[2]。此外，茶中含有大量可溶性物質，例如兒茶素、咖啡因、茶氨酸、多酚、有機酸和維生素等，這些物質含量的多少直接影響茶葉的質量[3]。根據加工方式的不同，茶葉可分為綠茶、白茶、紅茶、黑茶、黃茶和烏龍茶等不同類型[4]。已有報道表明，不同類型茶葉之間代謝物含量差異較大[5]。基于此，研究不同茶樹品種葉片中代謝物含量的差異就顯得尤為重要。

代謝組學是系統生物學的一種研究方法，它能夠對生物樣本中所有低分子量代謝產物進行定性和定量分析，并鑒定出具有重要生物學意義的組間顯著差異代謝物，闡明這些差異物的生理過程和代謝機制[6]。目前，代謝組學技術已被廣泛運用到茶產業的各個環節，更加全面地了解茶葉從栽培到加工過程中內含物質的變化規律，揭示茶葉風味形成的原因，從而提高茶葉品質和健全茶葉安全性保障[7?9]。

貴定云霧茶是世界名茶，已多次獲得國際大獎[10]。云霧野生茶樹主要分布在貴定縣南面云霧鎮的云霧山中，海拔高度1300 多米。茶樹葉色鮮綠，葉芽壯實肥大，形狀秀麗，茸毛較多，內部含有物質豐富，是優良的育種原料[11]。近些年來，隨著市場需求的變化，云霧茶也引進了小葉種，這就導致云霧茶在生產過程中出現加工混亂、品質差參不齊等現象。鑒于此，本文利用代謝組學研究貴定云霧茶本地種和引進種之間的代謝差異，結果可為云霧茶的加工工藝改良、滋味品質提升和功能性成分富集等方面提供依據。

1 材料和方法

1.1 材料與儀器

貴定云霧茶本地種（中葉種，寬橢圓形葉片，小喬木）、云霧茶引進種（小葉種，窄橢圓形葉片，灌木）茶樹樣品于2020年4月采自貴定縣云霧鎮茶場（26°34'48" N,107°13'52" E），每個品種隨機挑選9 株茶樹并采集新鮮葉片樣品，共18 個樣品；乙腈、氨水、甲醇、醋酸銨 色譜純，德國Merck 公司。

BSA124S-CW 型天平 德國賽多利斯科學儀器有限公司；D24 UV 純水儀 德國Merck Millipore公司；JXFSTPRP-24 型研磨儀 上海凈信科技有限公司；Agilent 1290 超高效液相色譜儀 美國安捷倫公司；TripleTOF 4600 型四極桿串聯飛行時間高分辨質譜儀 美國AB SCIEX 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品制備 將茶樹葉片置于研缽中加入液氮搗碎，接著用料理機打成粗粉，然后放入真空冷凍干燥機中冷凍干燥24 h，最后用組織研磨機研磨成細粉。每個茶樹稱取研磨后的粉末狀葉片樣品50 mg左右，加入500 μL 甲醇（含5 μg/mL L-2-氯-苯丙氨酸作為內標），勻漿破碎2 min。超聲功率為250 W，60 ℃下提取15 min。4 ℃，13000 r/min 離心15 min，取200 μL 上清進樣。每個茶樹品種設置9 個平行樣品。此外，取等量的18 份待測樣品進行混合，作為質控樣品。

1.2.2 色譜條件 色譜柱為XSelect ? HSS T3（2.5 μm,100 mm×2.1 mm）。流動相A：水溶液（0.1%甲酸），流動相B：乙腈溶液（0.1%甲酸）。流速：0.35 mL/min，柱溫：25 ℃，進樣量：2.0 μL。優化的色譜梯度為：0～2 min，5%B；2～10 min，5%～95%B；10～15 min，95%B；15～18 min，95%～5%B。

1.2.3 質譜條件 質譜以正、負離子兩種模式運行。優化的參數如下：毛細管電壓：正離子模式為4 kV，負離子模式為3.5 kV；掃描范圍70～1000 m/z；掃描速率7 Hz；毛細管溫度320 ℃；鞘氣流速45 PSI；輔助氣流速15 PSI。

1.3 數據處理

本研究利用XCMS 軟件和METLIN 數據庫對代謝物進行定性分析，首先將原始數據通過安捷倫Masshunter Qualitative Analysis 分析軟件轉換為通用格式（mz.data）。然后基于R 語言XCMS 程序對數據進行基線過濾、峰識別、積分、保留時間校正、峰對齊和歸一化處理，得到一個數據矩陣。接著將矩陣導入到SIMCA-P 軟件用于代謝物的定量分析和后續的主成分分析（principal component analysis,PCA）以及正交偏最小二乘判別分析（orthogonal least squares discriminant analysis,OPLS-DA），以檢測代謝差異物[12]。應用MetaboAnalyst 軟件和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes（KEGG）數據庫進行代謝通路分析[13]。最后根據差異代謝物含量的不同利用MeV 4.9 軟件進行熱圖分析[14]。

2 結果與分析

2.1 UPLC-QTOF-MS 鑒定結果

本研究基于UPLC-QTOF-MS 技術分析了貴定云霧茶本地種和引進種的代謝差異，結果同時與一級m/z 和碎片離子（二級）m/z 數據庫匹配到的代謝物正離子模式下為147 個（本地種147 個，引進種144 個），負離子模式下為361 個（本地種和引進種各361 個）。鑒于在負離子模式下可以檢測到更多的峰，并且在后續的多元統計分析中負離子模式下的模型參數更可靠和更具有預測性，所以本文的后續數據分析都采用負離子模式下采集到的數據。圖1即為本地種和引進種樣品在質譜ESI-條件模式下掃描的基峰圖。從圖1中可以看出本地種樣品在0.3～0.96 min、2.45～4.08 min 和7.94～10.95 min 時物質相對豐度較高，而引進種樣品在0.3～0.91 min、2.53～4.34 min 和7.95～10.93 min 時物質相對豐度較高，這表明不同品種茶樹樣品在負離子模式下的出峰數量和相對豐度存在一定的差異。

圖1 樣品負離子模式下基峰圖Fig.1 Base peak map of samples in negative mode

2.2 多元統計分析

將負離子模式下收集到的數據進行PCA 和OPLS-DA 分析，結果表明本地種和引進種樣品呈現出明顯的分離趨勢（圖2）。在PCA 得分圖中，主成分1 和2 的貢獻值分別為61.4%和23.8%，樣品累計貢獻值超過85%，說明代表性較好。另外，主成分分析也可以反映物質豐度的分布情況，越相似的樣品距離越近，反之則越遠。主成分分析中，本地種樣品主要分布在主成分1 的負軸位置，而引進種樣品主要分布在主成分1 的正軸位置，并且不同品種間的樣本距離較遠，這表明云霧茶本地種和引進種代謝物差異較大。OPLS-DA 得分圖中，各品種的樣本劃分明確，沒有分散，模型驗證后參數值R2X 為88.5%，R2Y 為92.4%，Q2為87.1%，值均接近1，說明負離子模型下具有較好的預測性和可靠性。

圖2 主成分分析和正交偏最小二乘判別分析Fig.2 Principal component analysis and orthogonal least squares discriminant analysis

2.3 差異代謝物和代謝通路分析

OPLS-DA 載荷圖可以直觀地顯示不同品種樣本間的差異代謝物，其中的各點代表不同的代謝物，距離坐標原點越遠越分散的為顯著差異代謝物。本研究對鑒定到的361 個代謝物進行差異性篩選，標準為VIP≥1、P<0.05 和FC≥2 或FC≤?2。其中FC（fold change）代表樣本間代謝物的差異倍數，即代謝物在本地種和引進種中含量的比值。結果共篩選到14 個顯著差異代謝物，OPLS-DA 載荷圖見圖3，其中包括4 種黃酮醇類物質（1～4 號）、4 種酚酸類物質（5～8 號）、3 種黃酮糖苷類物質（9～11 號）、2 種兒茶素（12～13 號）和1 種原花青素B1（14 號）（表1），均為茶樹常見的次生代謝產物，其中兒茶素是茶湯苦味的主要來源，黃酮醇和黃酮糖苷類物質對于澀味貢獻較大，這些物質含量的多少直接決定茶葉的品質。

表1 不同云霧茶樹品種的差異代謝物Table 1 Differencial metabolites between two varieties

圖3 正交偏最小二乘判別分析載荷圖Fig.3 Loading plot of orthogonal least squares discriminant analysis

根據14 種差異代謝物的相對豐度進行了熱圖分析（圖4）。結果顯示兒茶素和原花青素B1 在云霧茶本地種中含量較高，而黃酮醇和黃酮糖苷類物質在引進種中含量較高。

圖4 差異代謝物熱圖Fig.4 Heat map of differential metabolites between two varieties

另外，利用KEGG 數據庫對14 個差異代謝物進行代謝通路分析（圖5，圖6）。結果顯示這些差異代謝物主要集中分布于苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代謝途徑（phenylalanine,tyrosine and tryptophan biosynthesis）、類黃酮代謝途徑（flavnoid biosynthesis）以及黃酮和黃酮醇代謝途徑中（flavone and flavonol biosynthesis）。它們屬于茶葉代謝的主要途徑，直接影響著決定茶葉品質關鍵物質的積累。首先，4 種酚酸類差異代謝物集中在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代謝途徑中（圖5），這些物質含量的變化關系到苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的積累，間接影響茶葉的鮮味。其余10 種差異代謝物分布于類黃酮代謝途徑以及黃酮和黃酮醇代謝途徑中（圖6），這兩個途徑是類黃酮化合物合成的關鍵途徑。類黃酮化合物主要包括黃酮醇、黃酮、兒茶素（黃烷-3-醇）、花青素和原花青素等，在茶樹中其含量約占鮮葉干重的30%，遠高于其它物種[15]。在茶葉加工過程中，這些化合物含量的差異是制作不同茶類的依據。如Gai 等[16]利用代謝組學技術研究不同茶樹品種代謝差異時發現QN3 品種類黃酮生物合成途徑比較活躍，特別是兒茶素組分的含量明顯高于其它品種，基于此認為QN3 品種是綠茶加工的良好原料。Li 等[17]分析了適合綠茶和黑茶加工的不同茶樹品種的代謝特點，其中氨基酸和類黃酮類物質差異較大，研究結果為不同茶樹品種的加工提供參考依據。此外，Zeng 等[18]研究不同時期白茶葉片代謝組學時檢測到很多差異代謝物都分布在黃酮和黃酮醇代謝途徑中，尤其在葉片復綠期間黃酮醇和黃酮糖苷類物質含量增加顯著。同樣，已有報道表明較高含量的黃酮醇和黃酮糖苷類物質是白茶區別與其它類型茶葉的標志[15]。

圖5 苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代謝途徑Fig.5 Phenylalanine,tyrosine and tryptophan biosynthesis

圖6 黃酮和黃酮醇代謝途徑以及類黃酮代謝途徑Fig.6 Flavone and flavonol biosynthesis,and flavnoid biosynthesis

云霧茶本地種生長在貴定云霧山中，這里海拔高，晝夜溫差大，雨量充沛，云霧多，濕度較大。這些生態條件有利于含氮化合物和芳香類物質的積累，而澀味較重的黃酮醇和黃酮糖苷類物質含量則較低[19]。另外，茶葉中兒茶素、原花青素B1、黃酮醇和黃酮糖苷類物質在代謝途徑中存在共同前體（圖6），黃酮醇和黃酮糖苷組分合成的減少會相對的增加兒茶素和原花青素B1 的積累。這些物質含量的差異對于茶葉加工至關重要。已有研究表明白茶與綠茶之間代謝物含量分布存在較大差異，兒茶素組分含量白茶低于綠茶，而黃酮醇和黃酮糖苷類則相反[20]。這是因為綠茶加工過程中高溫殺青作用使多酚氧化酶等酶類活性鈍化后兒茶素得以保留[21?22]，同時高溫作用也會引起黃酮醇或黃酮糖苷類物質分解而導致含量降低[23?24]；而白茶全程萎凋的工藝特點使得葉片物理結構保持完整，酶活性未受破壞導致兒茶素組分較大程度降低，非酯型兒茶素尤為明顯，但是沒有高溫作用黃酮醇或黃酮糖苷類物質在白茶中得以保留[15,25]。花青素組分與兒茶素組分規律類似，大部分花青素組分在白茶中明顯低于綠茶，因為花青素萎凋過程中含量會降低[26]。在本研究中，原花青素B1 和2 種非酯型兒茶素在云霧茶本地種中要高于引進種，而3 種黃酮醇和4 種黃酮糖苷物質在引進種中要高于本地種。鑒于此得出，云霧茶本地種更適合綠茶的加工，而引進種更適合白茶的加工。

3 結論

本文利用UPLC-QTOF-MS 技術并結合多元統計方法分析了貴定云霧茶本地種和引進種之間的代謝差異，結果由于正離子模型參數不可靠且沒有預測性，只在負離子模型下鑒定出14 個顯著差異代謝物。這些差異代謝物主要分布于苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸代謝途徑、類黃酮代謝途徑以及黃酮和黃酮醇代謝途徑中。另外，不同茶樹品種中差異代謝物含量變化分析表明云霧茶本地種更適合綠茶的加工，而引進種更適合白茶的加工，但這些差異代謝物含量變化的具體生理過程和機制還有待后續深入的研究。綜上所述，本研究結果可為云霧茶的加工方法和良種選育提供理論依據。