氣相-離子遷移譜結合化學計量學方法快速區分不同年份釀造白酒

張敏敏，路巖翔，趙志國，崔 莉，閆慧嬌，王 曉，趙恒強,*

（1.齊魯工業大學（山東省科學院）山東省分析測試中心，山東濟南 250014；2.齊魯工業大學（山東省科學院）藥學院，山東濟南 250014；3.濟南市行政審批服務局，山東濟南 250001）

釀造白酒是我國的一種特有酒類，其以古老的釀造工藝和獨特的風味、口感聞名世界，是世界七大蒸餾酒之一[1]。根據香型不同，釀造白酒可以分為濃香型、清香型、醬香型和芝麻香型等多種類型[2]。其中醬香型白酒以其口味醇厚，余味悠長等特點深受廣大消費者喜愛，其中最具代表性的為茅臺酒[3]。醬香型釀造白酒品質與其窖藏年份有著重要的聯系。窖藏年份越久，釀造白酒中的辣味成分減少，酒味漸趨平和、綿柔，酒香較為醇厚、芬芳[4]。自20世紀90年代“年份酒”概念被引入中國白酒市場后，經過窖藏后的“年份酒”更得消費者親睞，價格也相對較高[5]。由于我國缺少關于釀造白酒年份鑒別的準則典籍和法律法規，導致目前“年份酒”市場較為混亂，以次充好、摻假等問題嚴重侵犯了消費者的合法利益[6]。目前，對于白酒的檢測方式一般分為人工評定和理化指標檢測兩種[7]。其中，人工評定法易受外界環境和個人主觀意識影響，且對評定人員的專業素質要求較高[8]。理化指標檢測一般是利用氣相色譜質譜、高效液相色譜等技術測定其中的某些成分，對實驗條件和環境以及實驗儀器的要求較高，且樣品需要預先進行復雜的前處理實驗，較為繁瑣[9?11]。熒光光譜技術可以通過多個樣本建立矩陣實現樣本的檢測，但前期工作需要人工尋找光譜特征量，預測準確性和客觀性有待進一步提高，也無法給出具體的化合物定性信息[12?13]。因此，亟需發展一種釀造酒年份快速檢測的技術來規范化年份酒市場。

氣相色譜離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectroscopy,GC-IMS）作為一種新興的檢測技術，是一種利用氣相色譜（gas chromatography,GC）結合離子遷移譜（ion mobility spectroscopy,IMS）對樣品中的揮發性成分進行快速檢測的技術[14]。該技術是基于復雜化合物組分經過氣相色譜柱的初步分離后，離子化化合物在特定的電場中通過固定的距離（漂移管）所需的漂移時間不同來實現的[15]。目前，該項技術在油類[16?17]、蜂蜜[18?20]、松茸等[21?22]食品摻假等方向已有廣泛應用。然而，在醬香型白酒年份快速區分領域應用較為少見。

本研究采用GC-IMS 技術對醬香型白酒（茅臺）的不同年份樣品（包含老熟樣本）進行了初步分析，并通過LAV 軟件快速生成指紋圖譜，結合主成分分析（principal component analysis,PCA）和主成分-聚類分析（principal component analysis-cluster analysis,PCA-CA）等計量學統計分析方法進行區分研究，對所含揮發性成分進行部分鑒別，為釀造白酒年份區分提供一種新方法、新技術。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

不同年份醬香型白酒茅臺 1-0（十年原酒）、1-1（十年老熟1 號）、1-2（十年老熟2 號）、1-3（十年老熟3 號），2-0（五年原酒）、2-1（五年老熟1 號）、2-2（五年老熟2 號）、2-3（五年老熟3 號），3-0（兩年原酒）、3-1（兩年老熟1 號）、3-2（兩年老熟2 號）、3-3（兩年老熟3 號） 山東七彩養生健康科技有限公司。

GAS FlavourSpec?氣相離子遷移譜 德國G.A.S.公司；HAMAG 20 mL 磁蓋螺口頂空瓶 浙江哈邁科技；SE-54（30 m×0.32 mm,0.25 μm） 非極性色譜柱 德國CS 色譜服務技術有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品預處理 分別吸取1.0 mL 白酒樣品置于20 mL 頂空進樣瓶中，加入2.0 mL 水稀釋后封蓋備用。

1.2.2 GC-IMS 實驗條件 GC-IMS 實驗過程中包含兩大部分：樣品孵育過程和進樣分析過程。其中進樣分析過程又包含氣相色譜柱預分離和離子遷移譜分離。因此，實驗條件包含孵育條件，GC 條件和IMS 條件三部分，詳見表1。

表1 GC-IMS 實驗條件Table 1 Test conditions of GC-IMS

1.3 數據處理

GC-IMS 得到的直觀實驗結果為一個以離子遷移時間為橫坐標，氣相保留時間為縱坐標的揮發性有機物點圖。需要對實驗數據進行進一步分析來實現本研究的研究目的。主要包含化合物定性分析，樣品間差異分析，指紋圖譜分析以及統計學分析四項。通過G.A.S.公司配置的軟件和內置的NIST 數據庫和IMS 數據庫對樣品中揮發性有機物進行定性；通過LAV 軟件和內置的 Gallery plot 插件、PCA analysis插件以及DPS 數據處理系統完成不同樣品的指紋圖譜分析，PCA 分析和PCA-CA 分析。

2 結果與分析

2.1 GC-IMS 條件優化

GC-IMS 分析方法是一種將GC 分析和IMS 分析相結合的二維分析方法，包含樣品富集進樣、GC 分離和IMS 分離等過程。合適的實驗條件將大大加快實驗效率和目標物的分離度，提高定性準確率。本研究分別從以下三部分對實驗條件進行優化：

樣品孵育過程是一個樣品中VOCs 的富集過程，孵育溫度和孵育時間均為該過程中的重要指標。在前期類似研究文獻基礎上[23]，本研究采用單因素實驗考察了孵育條件對醬香型白酒GC-IMS 分析的影響。優化過程中保持孵育時間為10 min 條件下，考察了40 和60 ℃兩個不同孵育溫度為唯一變量對樣品的影響，見圖1A，見圖1B。結果表明，60 ℃下孵育10 min 可得到較多的VOCs 信息。氣體洗脫程序是GC 分析過程中的重要因素，需要進行合適的優化。影響化合物在GC 柱上保留的主要因素是載氣流速（EPC2）。根據氣相色譜的特點，增加EPC2 會縮短化合物的保留時間。因此，本研究中對比了EPC2 的初始值為2 和10 mL/min 對化合物保留情況的影響，見圖1C，見圖1D，最終確定2 mL/min 為最佳初始值。IMS 檢測作為樣品的二次分離分析過程，主要影響因素為遷移管溫度（T1）。T1 的值越高，離子的活性越高，遷移時間越短，得到的化合物信息越少。因此，結合已有文獻[23]，T1 為45 ℃即可得到足夠的化合物信息。

圖1 優化過程的氣相-離子遷移譜圖Fig.1 Spectra of the optimization process

2.2 VOCs 定性分析

將處理好的樣品60 ℃孵育10 min 后，直接進行頂空進樣分析，30 min 后得到樣品的揮發性組分圖譜，見圖2。譜圖縱坐標為氣相保留時間（retention time of GC），橫坐標為離子遷移時間（drift time），整個圖譜中橫坐標1.0 位置為RIP（即反應離子峰，drift time 約為8.04 ms）。RIP 兩側的每一個點代表一種揮發性有機物，顏色深淺代表化合物的濃度高低，顏色越淺表示濃度較低，顏色越深則表示濃度越高，整個譜圖上的點即代表了樣品中檢測到的所有VOCs。

本研究中的12 個樣本均為同一類型白酒樣本，含有的化合物種類相似度較高，圖2以樣品3-3 為例對其中的部分化合物進行定性分析。本部分利用GCxIMS Library Search 軟件，通過內置的NIST 2014 氣相保留指數數據庫與IMS 遷移時間數據庫對其中的53 個峰進行了定性分析，化合物編號與圖2中的峰號一一對應，其中部分物質含有單體、二聚體兩個峰，具體VOCs 信息見表2。

表2 酒樣中檢測出的VOCsTable 2 VOCs detected in liquor samples

2.3 指紋圖譜對比分析

為了更直觀的對比不同年份酒樣中VOCs 成分的差異，本研究選取圖中的化合物峰作為待分析的點，通過LAV 軟件的Gallery Plot 插件生成VOCs指紋圖譜，見圖3。

由圖3可以看出：三組樣品的成分之間有較大差異，每組樣品組份內部之間的差異較小。圖3中用括號標注出了其中四處有明顯差異的區域（A、B、C、D）：其中，A 區域中的這些化合物在3 號組（兩年酒樣）中含量較高，而2 號組（五年酒樣）和1 號組（十年酒樣）中接近零點，說明這些化合物隨著貯藏年份的增加逐漸減少，其中包含α-蒎烯（α-Pinene），丁酸（Butanoic acid），異丙醇（Isopropyl alcohol）三個已鑒別成分；另外同年份酒樣中該部分化合物變化不明顯，說明老熟工藝對這部分化合物影響較小。B 區域中的這些化合物在3 個組份中均能檢測到，但2 號組（5年酒樣）中含量最高，說明這部分化合物隨著貯藏年份的增加含量先增加后減少，這些化合物可能穩定性較差，其中包含2,3-丁二酮（2,3-butanedione），乙酸丙酯（Propyl acetate），苯甲醛（Benzaldehyde）和癸醛（decanal）四個已鑒別成分，C 區域中的這些化合物在1 號組（10年酒樣）中含量較高，而2 號組（5年酒樣）和3 號組（2年酒樣）中含量較低且3 號組較2 號組中的含量更低，說明這些化合物隨著貯藏年份的增加逐漸累積且年份越長含量越高，其中包含乙酸異丁酯（Isobutyl acetate），2,6-二甲基-4-庚酮（2,6-dimethyl-4-heptanone），3-辛酮（3-Octanone）和1-戊醇（1-Pentanol）等已知化合物；另外同年份酒樣中該部分化合物變化不明顯，說明老熟工藝對這部分化合物的影響較小。D 區域中的這些化合物在3 號組（兩年酒樣）中含量最高，1 號組（十年酒樣）中含量次之，2 號組（五年酒樣）中含量最低，說明這部分化合物隨著貯藏年份的增加含量先減少后增加，這些化合物可能是內部物質分解或者是合成的產物，其中以已知化合物辛醛（Octanal）為代表。另外，可以看出同一年份不同老熟狀態的白酒樣本中隨著老熟工藝的加深部分化合物含量會呈現或增高或降低的變化，說明老熟工藝會對白酒成分的變化造成一定影響，但從C 和D 兩個區域看來不同老熟處理的十年酒樣本中成分變化較小，說明老熟工藝對十年酒的影響較弱。多項研究表明，新釀酒中除水和乙醇外約含2.0%的風味成分，其所含的風味成分隨著貯藏時間的增加呈“酸增酯減”的大體趨勢，經兩年貯藏后，大部分高含量成分如乙酸乙酯，乳酸乙酯，正丙醇，乙酸丙酯，正丁醇等含量已趨于穩定[24?25]，因此，本研究中雖在樣本中鑒別出其中的一些成分但對于貯藏時間長于兩年后的酒樣的區分貢獻不大，故生成區分的指紋圖譜中并未選用此類成分的峰。由圖2結合已鑒別成分可以看出，隨著貯藏年份的增加，許多醛酮類成分含量也在逐漸增加，醛類和酮類物質是香味的協調成分，有的醛類物質有較強的刺激性，可增大酒勁并襯托香氣[26]。圖中對貯藏年份2年及以上白酒的年份區分具有較大貢獻的未知化合物有待于進一步鑒別研究。

圖2 樣品的氣相-離子遷移譜圖（樣本3-3）Fig.2 Spectrogram of GC-IMS（sample 3-3）

圖3 不同年份白酒樣品的多成分差異性對比圖Fig.3 Comparison chart of multi-component differences of liquor samples

2.4 PCA 分析

PCA 分析可以實現數據的降維和規律性分析。通過對大量數據的矩陣分析，對特征向量進行標準化，從而減少數據維數，消除數據冗余，陸倫維等[27]已通過主成分分析方法對不等級的醬香型白酒實現了判別分析。為了更加直觀的對比各組分之間的差異，本研究利用LAV 軟件的PCA 分析插件對三組酒樣的12 個樣品進行主成分分析，相關矩陣的特征值等信息如表3所示。表3中顯示了6 個特征主成分信息，其中前2 個主成分的累積方差貢獻率高達90%以上，即前2 個主成分即可解釋90%以上的數據信息，故選取前2 個主成分進行樣品的進一步區分具有較強的可靠性。

表3 相關矩陣的特征值Table 3 Eigen-values of the correlation matrix

PC1 和PC2 兩個數據集的總得分高達94%，即可以解釋總變異的94%，以主成分PC1 為橫坐標，PC2 為縱坐標建立樣本的二維得分圖譜，結果見圖4。由圖4可知，每個樣品組組內在圖譜中的分類較為明顯，組間分布較遠，達到了較好的區分效果。

圖4 12 個樣品的PCA 分析圖譜Fig.4 PCA analysis pattern of 12 samples

2.5 PCA-CA 分析

主成分分析消除了指標間相關性對結果的影響并對樣本進行了簡單的區分，但并不能明確的顯示樣品間的聚類差異。因此，本研究中將PCA 分析與CA 分析相結合，這樣既避免指標間相關性對結果的影響，避免指標的取舍問題，降低計算量，同時又可以快速簡單地將分類結果用樹狀圖表示出來，增強結果的可讀性。由圖5可以看出，自然陳釀年份的影響占據了絕對優勢，樣本明確的分為3 類：第一類（10年酒）中，隨著老熟工藝的應用，樣品間的距離越來越遠；第二類（5年酒）中，2-3 號樣本距離其余樣品最遠，原因可能是對于第二類樣本來說，老熟處理工藝的影響較大；第三類（2年酒）中，3-0（原酒）與3-1 號樣本為一小組聚類，3-2 號樣本與3-3 號樣本為一小組聚類，說明這兩小組組內樣本間差異較小，而且聚類規律并未隨著老熟工藝的進行而產生規律性變動，可能是新酒穩定性差的原因。另外，第一類與第二類樣本間的距離較近，第三類樣本與其余樣本相聚最遠可能是由于第三類中的白酒樣本年份較新，樣品較不穩定。隨著貯藏年份的增加，白酒中的物質漸趨平衡穩定，因此第二類與第三類樣本的距離較近。

圖5 12 個樣本的PCA-CA 分析圖譜Fig.5 PCA-CA analysis spectrum of 12 samples

3 結論

本研究首次將GC-IMS 技術和PCA-CA 數據處理方法相結合，并進一步詳細研究其在醬香型釀造白酒年份快速鑒別中的應用，實現不同年份釀造白酒的快速區分。研究發現GC-IMS 技術可以快速、準確的對白酒中的揮發性有機物進行鑒別，其中在本研究對象中共鑒別出53 種成分，結合儀器自帶軟件形成VOCs 指紋圖譜進行初步的白酒樣本中化合物差異性對比。PCA-CA 數據處理方法消除了GCIMS 產生的大量的揮發性有機物指標間相關性對結果的影響，避免指標的取舍問題，降低數據維度和計算量，同時又可以快速簡單地將分類結果和遠近關系用樹狀圖表示出來，增強結果的可讀性。本研究通過GC-IMS 技術和PCA-CA 數據處理相結合的方法快速實現了三組不同貯藏年份白酒的區分。然而，受樣本數量較少和樣本分散程度不均勻等問題的約束該方法仍有很大的提高空間，后續應進一步提升和優化。