LC-MS/MS 用于頭孢拉定膠囊強(qiáng)制降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)分析

黃道明，鄭露盼，張繼紅

上饒市食品藥品檢驗(yàn)檢測中心，江西 上饒 334000

頭孢拉定是第一代半合成頭孢菌素，結(jié)構(gòu)式見圖1。其合成方法以化學(xué)合成法為主：即以7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸（7-ADCA）經(jīng)成鹽或酯化后，與經(jīng)保護(hù)后的雙氫苯甘氨酸中間體縮合，再水解、結(jié)晶得到頭孢拉定［1］。隨著對藥品雜質(zhì)特性的深入研究，依據(jù)雜質(zhì)的藥理特性,逐一制定每一個雜質(zhì)限度的“雜質(zhì)譜控制理念”已經(jīng)被國內(nèi)外普遍接受［2-5］。本研究前期采用了HPLC 法測定頭孢拉定膠囊強(qiáng)制降解產(chǎn)物，明確了頭孢拉定膠囊粉末在酸、堿及氧化條件下均有明顯的降解產(chǎn)物生成［6］。而本次研究根據(jù)雜質(zhì)譜控制理念，運(yùn)用強(qiáng)制降解試驗(yàn)，進(jìn)一步對頭孢拉定膠囊強(qiáng)降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及來源進(jìn)行推測，為頭孢拉定制劑穩(wěn)定性研究提供重要依據(jù)，為藥品生產(chǎn)、運(yùn)輸及貯存條件提供重要參考［7-11］。

圖1 頭孢拉定化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 儀器與試藥

1.1 儀器

WatersTQ-S 液相質(zhì)譜儀（美國沃特世），電子天平（Sartorius 公司），恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），pH 計(jì)（Thermo 公司）。

1.2 試劑試藥

頭孢拉定膠囊（A 企業(yè)，批號：200310，250 mg/粒）；頭孢拉定對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130427-201107，含量88.3%），頭孢氨芐對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130408-201411，含量94.4%）；乙腈、甲醇為質(zhì)譜純（德國EMD Millipore 公司），甲酸（Formic Acid），水（市售屈臣氏飲用水）。

2 方法

2.1 色譜條件

采用SuperLu C18（100 mm×2.1 mm,1.8 μm）色譜柱，以0.2%甲酸溶液-乙腈（90∶10）為流動相，流速為0.3 mL/min,柱溫為30 ℃,進(jìn)樣量為5 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

電子噴霧離子源（ESI）正離子模式，噴霧電壓4 500 V；錐孔電壓20 V；離子源電壓50 V；離子源溫度150 ℃；霧化氣壓力7.00 bar；錐孔氣流量150 L/Hr；噴霧氣流量1 000 L/Hr；碰撞能量10～40 eV；采用全掃描模式，掃描質(zhì)量數(shù)范圍50～500 m/z。

2.3 樣品制備

2.3.1 供試品溶液的制備精密稱取頭孢拉定膠囊內(nèi)容物25 mg，置于25 mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.3.2 對照品溶液的制備精密稱取頭孢拉定對照10.25 mg，置100 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.3.3 強(qiáng)制降解試驗(yàn)溶液的制備強(qiáng)制降解條件如下：酸破壞（1 mol/L HCl 1 mL，50 ℃水浴，1 h）；堿破壞（0.05 mol/L NaOH 1 mL，50 ℃水浴，3 h）；氧化破壞（0.5% H2O21 mL，室溫，1 h）。酸破壞和堿破壞在終止破壞前用相應(yīng)濃度的NaOH 溶液和HCl 溶液中和，所有破壞樣品最終用水稀釋成含頭孢拉定約1 mg/mL 的強(qiáng)制降解試驗(yàn)溶液。

2.4 結(jié)果

2.4.1 強(qiáng)制降解試驗(yàn)結(jié)果強(qiáng)制降解試驗(yàn)結(jié)果表明：在酸、堿和氧化試驗(yàn)均產(chǎn)生相應(yīng)雜質(zhì)，三種條件下雜質(zhì)種類和數(shù)量有區(qū)別，尤其是在氧化試驗(yàn)條件和堿強(qiáng)制降解條件下區(qū)別明顯，酸強(qiáng)制降解條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)與氧化試驗(yàn)條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)相似。隨著強(qiáng)制降解條件的加強(qiáng)，雜質(zhì)的離子流豐度越來越強(qiáng)。在供試品中除主峰外還檢出了雜質(zhì)12 頭孢氨芐和相對保留時間為1.67 的雜質(zhì)11，質(zhì)荷比352 m/z 推測為4'-5'-二氫頭孢拉定，且該雜質(zhì)峰在堿強(qiáng)制降解條件下容易被降解。

圖2 總離子流圖（50～500m/z）：a 氧化試驗(yàn)；

2.4.2 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)的分析首先根據(jù)一級質(zhì)譜掃描得到各雜質(zhì)的母離子，確定其相對分子質(zhì)量和元素信息，再根據(jù)二級質(zhì)譜獲得碎片信息，結(jié)合化合物的一般裂解規(guī)律，推測其可能的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

雜質(zhì)1 相對保留時間為0.1，氧化試驗(yàn)產(chǎn)生，一級質(zhì)譜圖中［M+H］+離子峰為416 m/z，與［C16H21N3O8S］+離子式相對應(yīng)，二級質(zhì)譜掃描的離子碎片峰399、273、158、140 m/z 等，均可由此結(jié)構(gòu)經(jīng)合理裂解產(chǎn)生。推測裂解過程及二級質(zhì)譜圖見圖3。

圖3 416 m/z結(jié)構(gòu)裂解過程圖（a）和二級質(zhì)譜圖（b）

表1 強(qiáng)降解產(chǎn)物的LC-MS/MS信息

雜質(zhì)2 和雜質(zhì)3 相對保留時間分別為0.12 和0.16，在酸降解，氧化試驗(yàn)中均有產(chǎn)生，其質(zhì)譜圖基本相同，［M+H］+離子峰為366.24 m/z，［M+Na］+離子峰為離子388.11 m/z，與［C16H19N3O5S］+離子式相對應(yīng)。子離子峰348 m/z，為［M+H］+離子脫去一分子H2O 后形成的碎片離子，說明結(jié)構(gòu)中含有裸露的羥基。子離子峰322 m/z 與［M+H］+離子相差44，推測為［M+H］+離子脫去一個羧基，說明結(jié)構(gòu)中含有羧基，綜上所述，見圖4a（為《歐洲藥典》雜質(zhì)C 和D 異構(gòu)體）和圖4b，質(zhì)譜圖見圖4c。

圖4 雜質(zhì)2和3的結(jié)構(gòu)圖（a、b；368 m/z）和質(zhì)譜圖（c）

雜質(zhì)4、雜質(zhì)5 和雜質(zhì)6 相對保留時間分別為0.33、0.39 和1.11，在酸、堿降解和氧化試驗(yàn)中均有產(chǎn)生。其［M+H］+離子峰均為368 m/z，質(zhì)譜圖相似，與［C16H21N3O5S］+離子式相對應(yīng)，可能為同分異構(gòu)體。有文獻(xiàn)報(bào)道［1］推測為β-內(nèi)酰胺環(huán)上的酰胺鍵斷裂，被氧化水解形成羧基。在氧化試驗(yàn)中還產(chǎn)生了雜質(zhì)7 相對保留時間為0.2，其［M+H］+離子峰也為368 m/z，其離子碎片與雜質(zhì)4、5 和6 的子離子碎片相似，但有一定差別，其結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步考察，結(jié)構(gòu)見圖5。

圖5 368 m/z結(jié)構(gòu)圖

雜質(zhì)8 相對保留時間為0.58，在氧化試驗(yàn)中產(chǎn)生。在質(zhì)譜圖中存在340 m/z 和363 m/z 的離子峰，分別推測為［M+H］+和［M+Na］+峰，即雜質(zhì)8相對分子質(zhì)量為339。其二級質(zhì)譜子離子碎片189、122、322、278、305 m/z，均可由此結(jié)構(gòu)經(jīng)合理裂解產(chǎn)生。推測裂解過程及質(zhì)譜圖，見圖6 和圖7。

圖6 雜質(zhì)8裂解過程圖

圖7 雜質(zhì)8質(zhì)譜圖

雜質(zhì)9 和雜質(zhì)10 相對保留時間分別為0.26和0.45，均在堿降解試驗(yàn)中產(chǎn)生。雜質(zhì)9 質(zhì)譜圖中［M+H］+離子峰為177m/z，子離子峰149m/z為［M+H］+脫去一個羰基［4］，質(zhì)譜圖及結(jié)構(gòu)推測如圖8。雜質(zhì)10［M+H］+離子峰為220 m/z，其結(jié)構(gòu)有待進(jìn)一步考察。

圖8 雜質(zhì)9和10的質(zhì)譜圖（a,b）及雜質(zhì)9（c）結(jié)構(gòu)推測

3 討論

3.1 色譜條件選擇與優(yōu)化

據(jù)報(bào)道，對本品進(jìn)行雜質(zhì)檢查時大多采用磷酸鹽緩沖液作為流動相，不適合電噴霧離子化的質(zhì)譜分析。本研究建立了適合頭孢拉定LC-MS/MS 分析的色譜條件，并對其進(jìn)行了優(yōu)化。通過對甲醇:水、甲醇：0.1%甲酸水、乙腈：水、乙腈：0.05%甲酸水、乙腈：0.1%甲酸水、乙腈：0.2%甲酸水、乙腈:醋酸銨緩沖溶液和甲醇：醋酸銨緩沖溶液等8 種流動相系統(tǒng)，分別調(diào)節(jié)不同比例進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明在“2.1”項(xiàng)流動相條件下，頭孢拉定峰保留時間適當(dāng)，雜質(zhì)有效分離，且峰型好，是較理想的流動相。

3.2 頭孢拉定強(qiáng)降解雜質(zhì)

本研究采用LC-MS/MS 分析法，檢測出頭孢拉定膠囊強(qiáng)制降解產(chǎn)物12 個，根據(jù)質(zhì)譜分析和相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，其中可能包含了《歐洲藥典》收載的雜質(zhì)C 和雜質(zhì)D，以及頭孢氨芐和4'-5'-二氫頭孢拉定等已知雜質(zhì)。其余為未知雜質(zhì)，其中m/z368 的雜質(zhì)有4 個，有文獻(xiàn)報(bào)道其1 種相關(guān)結(jié)構(gòu)，針對這4 種雜質(zhì)是同分異構(gòu)體還是不同物質(zhì)，有待進(jìn)一步考察。其余的未知雜質(zhì)結(jié)構(gòu)未見相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。利用二級質(zhì)譜進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，推測出其可能的結(jié)構(gòu)，但結(jié)構(gòu)的精準(zhǔn)鑒定還有待借助多種手段進(jìn)一步確證。