LC-MS/MS 用于頭孢拉定膠囊強制降解產物的結構分析

黃道明，鄭露盼，張繼紅

上饒市食品藥品檢驗檢測中心，江西 上饒 334000

頭孢拉定是第一代半合成頭孢菌素，結構式見圖1。其合成方法以化學合成法為主：即以7-氨基去乙酰氧基頭孢烷酸（7-ADCA）經成鹽或酯化后，與經保護后的雙氫苯甘氨酸中間體縮合，再水解、結晶得到頭孢拉定［1］。隨著對藥品雜質特性的深入研究，依據雜質的藥理特性,逐一制定每一個雜質限度的“雜質譜控制理念”已經被國內外普遍接受［2-5］。本研究前期采用了HPLC 法測定頭孢拉定膠囊強制降解產物，明確了頭孢拉定膠囊粉末在酸、堿及氧化條件下均有明顯的降解產物生成［6］。而本次研究根據雜質譜控制理念，運用強制降解試驗，進一步對頭孢拉定膠囊強降解產物的結構及來源進行推測，為頭孢拉定制劑穩定性研究提供重要依據，為藥品生產、運輸及貯存條件提供重要參考［7-11］。

圖1 頭孢拉定化學結構

1 儀器與試藥

1.1 儀器

WatersTQ-S 液相質譜儀（美國沃特世），電子天平（Sartorius 公司），恒溫水浴鍋（北京市永光明醫療儀器有限公司），pH 計（Thermo 公司）。

1.2 試劑試藥

頭孢拉定膠囊（A 企業，批號：200310，250 mg/粒）；頭孢拉定對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130427-201107，含量88.3%），頭孢氨芐對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130408-201411，含量94.4%）；乙腈、甲醇為質譜純（德國EMD Millipore 公司），甲酸（Formic Acid），水（市售屈臣氏飲用水）。

2 方法

2.1 色譜條件

采用SuperLu C18（100 mm×2.1 mm,1.8 μm）色譜柱，以0.2%甲酸溶液-乙腈（90∶10）為流動相，流速為0.3 mL/min,柱溫為30 ℃,進樣量為5 μL。

2.2 質譜條件

電子噴霧離子源（ESI）正離子模式，噴霧電壓4 500 V；錐孔電壓20 V；離子源電壓50 V；離子源溫度150 ℃；霧化氣壓力7.00 bar；錐孔氣流量150 L/Hr；噴霧氣流量1 000 L/Hr；碰撞能量10～40 eV；采用全掃描模式，掃描質量數范圍50～500 m/z。

2.3 樣品制備

2.3.1 供試品溶液的制備精密稱取頭孢拉定膠囊內容物25 mg，置于25 mL 容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.3.2 對照品溶液的制備精密稱取頭孢拉定對照10.25 mg，置100 mL 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.3.3 強制降解試驗溶液的制備強制降解條件如下：酸破壞（1 mol/L HCl 1 mL，50 ℃水浴，1 h）；堿破壞（0.05 mol/L NaOH 1 mL，50 ℃水浴，3 h）；氧化破壞（0.5% H2O21 mL，室溫，1 h）。酸破壞和堿破壞在終止破壞前用相應濃度的NaOH 溶液和HCl 溶液中和，所有破壞樣品最終用水稀釋成含頭孢拉定約1 mg/mL 的強制降解試驗溶液。

2.4 結果

2.4.1 強制降解試驗結果強制降解試驗結果表明：在酸、堿和氧化試驗均產生相應雜質，三種條件下雜質種類和數量有區別，尤其是在氧化試驗條件和堿強制降解條件下區別明顯，酸強制降解條件下產生的雜質與氧化試驗條件下產生的雜質相似。隨著強制降解條件的加強，雜質的離子流豐度越來越強。在供試品中除主峰外還檢出了雜質12 頭孢氨芐和相對保留時間為1.67 的雜質11，質荷比352 m/z 推測為4'-5'-二氫頭孢拉定，且該雜質峰在堿強制降解條件下容易被降解。

圖2 總離子流圖（50～500m/z）：a 氧化試驗；

2.4.2 雜質結構的分析首先根據一級質譜掃描得到各雜質的母離子，確定其相對分子質量和元素信息，再根據二級質譜獲得碎片信息，結合化合物的一般裂解規律，推測其可能的化學結構。

雜質1 相對保留時間為0.1，氧化試驗產生，一級質譜圖中［M+H］+離子峰為416 m/z，與［C16H21N3O8S］+離子式相對應，二級質譜掃描的離子碎片峰399、273、158、140 m/z 等，均可由此結構經合理裂解產生。推測裂解過程及二級質譜圖見圖3。

圖3 416 m/z結構裂解過程圖（a）和二級質譜圖（b）

表1 強降解產物的LC-MS/MS信息

雜質2 和雜質3 相對保留時間分別為0.12 和0.16，在酸降解，氧化試驗中均有產生，其質譜圖基本相同，［M+H］+離子峰為366.24 m/z，［M+Na］+離子峰為離子388.11 m/z，與［C16H19N3O5S］+離子式相對應。子離子峰348 m/z，為［M+H］+離子脫去一分子H2O 后形成的碎片離子，說明結構中含有裸露的羥基。子離子峰322 m/z 與［M+H］+離子相差44，推測為［M+H］+離子脫去一個羧基，說明結構中含有羧基，綜上所述，見圖4a（為《歐洲藥典》雜質C 和D 異構體）和圖4b，質譜圖見圖4c。

圖4 雜質2和3的結構圖（a、b；368 m/z）和質譜圖（c）

雜質4、雜質5 和雜質6 相對保留時間分別為0.33、0.39 和1.11，在酸、堿降解和氧化試驗中均有產生。其［M+H］+離子峰均為368 m/z，質譜圖相似，與［C16H21N3O5S］+離子式相對應，可能為同分異構體。有文獻報道［1］推測為β-內酰胺環上的酰胺鍵斷裂，被氧化水解形成羧基。在氧化試驗中還產生了雜質7 相對保留時間為0.2，其［M+H］+離子峰也為368 m/z，其離子碎片與雜質4、5 和6 的子離子碎片相似，但有一定差別，其結構有待進一步考察，結構見圖5。

圖5 368 m/z結構圖

雜質8 相對保留時間為0.58，在氧化試驗中產生。在質譜圖中存在340 m/z 和363 m/z 的離子峰，分別推測為［M+H］+和［M+Na］+峰，即雜質8相對分子質量為339。其二級質譜子離子碎片189、122、322、278、305 m/z，均可由此結構經合理裂解產生。推測裂解過程及質譜圖，見圖6 和圖7。

圖6 雜質8裂解過程圖

圖7 雜質8質譜圖

雜質9 和雜質10 相對保留時間分別為0.26和0.45，均在堿降解試驗中產生。雜質9 質譜圖中［M+H］+離子峰為177m/z，子離子峰149m/z為［M+H］+脫去一個羰基［4］，質譜圖及結構推測如圖8。雜質10［M+H］+離子峰為220 m/z，其結構有待進一步考察。

圖8 雜質9和10的質譜圖（a,b）及雜質9（c）結構推測

3 討論

3.1 色譜條件選擇與優化

據報道，對本品進行雜質檢查時大多采用磷酸鹽緩沖液作為流動相，不適合電噴霧離子化的質譜分析。本研究建立了適合頭孢拉定LC-MS/MS 分析的色譜條件，并對其進行了優化。通過對甲醇:水、甲醇：0.1%甲酸水、乙腈：水、乙腈：0.05%甲酸水、乙腈：0.1%甲酸水、乙腈：0.2%甲酸水、乙腈:醋酸銨緩沖溶液和甲醇：醋酸銨緩沖溶液等8 種流動相系統，分別調節不同比例進行試驗，結果表明在“2.1”項流動相條件下，頭孢拉定峰保留時間適當，雜質有效分離，且峰型好，是較理想的流動相。

3.2 頭孢拉定強降解雜質

本研究采用LC-MS/MS 分析法，檢測出頭孢拉定膠囊強制降解產物12 個，根據質譜分析和相關文獻報道，其中可能包含了《歐洲藥典》收載的雜質C 和雜質D，以及頭孢氨芐和4'-5'-二氫頭孢拉定等已知雜質。其余為未知雜質，其中m/z368 的雜質有4 個，有文獻報道其1 種相關結構，針對這4 種雜質是同分異構體還是不同物質，有待進一步考察。其余的未知雜質結構未見相關文獻報道。利用二級質譜進行結構解析，推測出其可能的結構，但結構的精準鑒定還有待借助多種手段進一步確證。