白藜蘆醇調控Treg/Th17 抑制潰瘍性結腸炎腸道黏膜炎癥的實驗研究

顧秋平，朱方擎，劉金金，謝俊鋒，湯建華

贛州市人民醫院，江西 贛州 341000

潰瘍性結腸炎（ulcerative colitis，UC）是炎癥性腸病的一種類型［1］，發病人數逐年增多，其發病表現為炎癥反應持續時間長，病情反復，不易醫治。截至目前，UC 的成因以及發病機制還在研究當中，有研究顯示，它的發生可能和遺傳以及腸道黏膜免疫反應有一定的關聯［2］。白藜蘆醇存在于自然界很多植物中，屬于酚類化合物，具有抑制炎癥、抗腫瘤等功效，與此同時，還能保護機體的重要臟器［3-4］。本研究通過建立UC 模型小鼠，研究調節性T 細胞（Treg）/輔助性T 細胞17（Th17）在白藜蘆醇治療UC 中的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康SPF 級C57BL/6 小鼠50 只，8 周齡，雌雄各半，體質量20～25 g，購于廣東省醫學動物實驗中心，飼養于贛州市人民醫院屏障級動物房，12 h 光照和黑暗循環，室內溫度22±2℃，濕度45%～55%。

1.2 主要試劑與儀器

白藜蘆醇（含量≥98%，上海源葉公司）；PBS 緩沖液（上海索萊寶公司）；莫能霉素（武漢欣欣佳麗公司）；白細胞介素17（IL-17）ELISA試劑盒（北京中檢公司）；白細胞介素23（IL-23）ELISA 試劑盒（北京中檢公司）；FBS（上海慧穎公司）；流式細胞儀（型號：Callibur Ⅱ，美國Becton Dickinson 公司）；臺式高速冷凍離心機（型號：TGL-16，湖南湘儀離心機儀器有限公司）。

1.3 實驗方法

將小鼠隨機分為5 組，每組10 只。陰性對照組飲用純化水，模型對照組、陽性對照組與白藜蘆醇（Res）組飲用5%葡聚糖硫酸鈉（DSS）7 d建立UC 模型。造模完成后，陰性對照組與模型對照組每日灌胃0.5%羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）0.2 mL；Res 低劑量組每日灌胃0.5%CMC-Na 溶解的8 mg/mL 的Res 0.2 mL；Res 高劑量組每日灌胃0.5%CMC-Na 溶解的16 mg/mL 的Res 0.2 mL；陽性對照組每日灌胃0.5%CMC-Na 溶解的16 mg/mL 的柳氮磺吡啶栓（SASP）0.2 mL，5 組均連續給藥14 d。采用眼眶采血法采集小鼠外周血，離心分離得血清進行ELISA 檢測；頸椎脫臼法處死小鼠，分離腸道黏膜組織，提取淋巴細胞進行測定，按照ELISA 試劑盒檢測腸道黏膜組織IL-17 和IL-23 水平。

淋巴細胞提取方法：將腸黏膜組織放入細胞篩網內，加入PBS 后研磨組織，收集單細胞懸液，500 g、4 ℃離心5 min，重懸單細胞懸液，調整細胞密度為1×106個/mL。隨后加入莫能霉素，250 g 離心10 min，棄上清液，用含5% 胎牛血清（FBS）的PBS重懸，洗滌細胞兩次，收集細胞。

1.4 觀察指標

（1）比較各組小鼠Treg 和Th17 在T 淋巴細胞的占比以及Treg/Th17 比值。（2）各組腸道黏膜組織IL-17 和IL-23 的表達。（3）比較各組小鼠外周血IL-1β、IL-6 和TNF-α 的表達。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 腸道黏膜T 細胞亞群水平

各組Treg、Th17 以及Treg/Th17 均有差異（F=128.160、117.756、79.115，P<0.001）。與陰性對照組比較，模型對照組小鼠Treg 細胞占比、Treg/Th17 下調，Th17 細胞占比上調，差異有統計學意義（P<0.05）。與模型對照組比較，Res 低劑量組、Res 高劑量組以及陽性對照組Treg 細胞占比、Treg/Th17 上調，Th17 細胞占比下調，差異有統計學意義（P<0.05）。與Res 低劑量相比，Res 高劑量組以及陽性對照組Treg 細胞占比、Treg/Th17 上調，Th17 細胞占比下調，差異有統計學意義（P<0.05）。見表1。

表1 各組小鼠腸道黏膜T細胞亞群水平比較（）

表1 各組小鼠腸道黏膜T細胞亞群水平比較（）

注：與陰性對照組比較，aP<0.05，與模型對照組比較，bP<0.05，與Res低劑量組比較，cP<0.05。

2.2 黏膜組織IL-17 以及IL-23 的表達

各組腸道黏膜IL-17、IL-23 表達差異有統計學意義（F=158.901、128.330，P<0.001）。與陰性對照組比較，模型對照組IL-17、IL-23 上調，差異有統計學意義（P<0.05）。與模型對照組比較，Res 低劑量組、Res 高劑量組以及陽性對照組IL-17、IL-23 下調，差異有統計學意義（P<0.05）。與Res 低劑量相比，Res 高劑量組以及陽性對照組IL-17、IL-23 下調，差異有統計學意義（P<0.05）。見表2。

表2 各組小鼠IL-17以及IL-23的表達（pg/mg，）

表2 各組小鼠IL-17以及IL-23的表達（pg/mg，）

注：與陰性對照組比較，aP<0.05，與模型對照組比較，bP<0.05，與Res低劑量組比較，cP<0.05。

2.3 小鼠外周血炎癥因子的表達

各組外周血IL-1β、IL-6 和TNF-α 表達均存在 差 異（F=224.912、84.953、77.228，P<0.001）。與陰性對照組比較，模型對照組IL-1β、IL-6 和TNF-α 上調，差異有統計學意義（P<0.05）。與模型對照組比較，Res 低劑量組、Res 高劑量組以及陽性對照組IL-1β、IL-6 和TNF-α 下調，差異有統計學意義（P<0.05）。與Res 低劑量相比，Res高劑量組以及陽性對照組IL-1β、IL-6 和TNF-α下調，差異有統計學意義（P<0.05）。見表3。

表3 各組小鼠外周血炎癥因子的表達（nmol/L，）

表3 各組小鼠外周血炎癥因子的表達（nmol/L，）

注：與陰性對照組比較，aP<0.05，與模型對照組比較，bP<0.05，與Res低劑量組比較，cP<0.05。

3 討論

相關研究顯示，Th17、Treg 細胞參與了UC 的發病，與之有著不容忽視的關聯［5-6］。Th17 細胞能夠生成IL-17，并將之分泌到細胞外，參與到炎癥反應。在炎性腸病的發展當中，IL-17 能夠聯合IL-23 加重炎癥反應。Treg 細胞的功能便是負性調節機體的炎癥反應，另外，它還參與了外周免疫耐受的產生、免疫平衡的穩定，對維持機體穩態意義重大。本實驗結果，模型對照組小鼠腸黏膜組織中的Treg 細胞占比在下調，Th17 細胞則在上調，且Treg/Th17 也在下調，說明模型對照組小鼠體內存在Treg 和Th17 比例失衡。進一步檢測IL-17 以及IL-23 水平，發現模型對照組IL-17 和IL-23 水平的確存在上調，進一步印證了Treg 和Th17 比例的失衡。

各種細胞因子在UC 的發生與發展中也會起到一定的作用［7］，這些細胞因子主要由免疫細胞產生，有連結各免疫細胞功能的作用，使得免疫功能更加迅速與穩定；另外，細胞還能通過分泌到細胞外，導致機體發生炎癥反應。促炎性細胞因子［8］（IL-1、IL-6 和TNF-α 等）被認為與UC 的發生關聯重大。在UC 發生時，這些促炎因子能導致中性粒細胞以及巨噬細胞等免疫細胞數量大量增長，進一步分泌更多促炎因子來加重自身炎癥反應，UC 的發作也變得嚴重又漫長，對腸黏膜組織造成嚴重傷害。本實驗結果，模型對照組小鼠促炎性細胞因子釋放增加，說明UC 小鼠機體炎癥作用很劇烈，UC 會導致促炎因子大量釋放。

白藜蘆醇屬于多酚類物質，其主要在抗氧化，抗炎以及抗腫瘤等方面發揮作用［9］。目前很多研究中，白藜蘆醇也參與到了UC 預防和治療當中［10］。也有臨床研究顯示，口服白藜蘆醇能夠顯著降低UC 患者腸道炎癥反應，改善患者的臨床病癥。在UC 動物實驗中，白藜蘆醇能降低UC 小鼠的氧化應激并且能下調促炎因子的表達。本實驗結果，在使用了白藜蘆醇干預后，Treg 細胞百分比上升，Th17細胞百分比下降，Treg/Th17 比值上升，在向正常小鼠接近，IL-17 以及IL-23 的表達也在降低。檢測炎癥因子的表達發現IL-1β、IL-6 和TNF-α 均下降，且高劑量的白藜蘆醇對上述指標的改善作用更加明顯。說明白藜蘆醇能通過調控Treg/Th17 免疫平衡來降低炎癥因子的表達，減輕炎癥反應，并且高劑量作用效果更佳。