甜瓜再生體系的建立

祁宏英 徐洪國(guó) 王秀文 王芳 尹幫果 高美玲

摘 要：以葫蘆科的甜瓜為試驗(yàn)對(duì)象，探討不同基因型、不同激素濃度配比及抗生素脅迫對(duì)其不定芽萌發(fā)的影響，以期建立甜瓜再生培養(yǎng)體系，為甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化奠定基礎(chǔ)。結(jié)果表明，甜瓜在初代培養(yǎng)時(shí)，不定芽發(fā)生的培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-1 6-BA，甜瓜再生率最高，達(dá)到92.5%;甜瓜在繼代培養(yǎng)中，0.3 mg·L-1 6-BA的處理最適宜不定芽的伸長(zhǎng)生長(zhǎng)，0.7 mg·L-1 6-BA的處理甜瓜不定芽增殖系數(shù)最高達(dá)到2.33;當(dāng)Kan（卡那霉素）質(zhì)量濃度大于 20 mg·L-1 時(shí)，外植體基本全部褐化，無(wú)法分化出綠芽。Amp（氨芐青霉素）在一定質(zhì)量濃度下對(duì)不定芽發(fā)生的影響差異性不顯著。

關(guān)鍵詞：甜瓜;不定芽;再生;抗生素

中圖分類號(hào)：S652 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-2871（2021）05-105-04

Optimization of regeneration system of melon

QI Hongying1，2， XU Hongguo1，2， WANG Xiuwen1， WANG Fang1，2， YIN Bangguo1， GAO Meiling1，2

（1.College of Life Science and Agriculture Forestry， Qiqihar University， Qiqihar 161006， Heilongjiang， China; 2. Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Resistance Gene Engineering and Protection of Biodiversity in Cold Areas， Qiqihar 161006， Heilongjiang， China）

Abstract： In this experiment， the effects of different hormone combinations on the regeneration system of different genotypes of melon were studied，and the effects of different hormone combinations and genotypes on the regeneration of melon lines were studied， and the effects of antibiotics on the tolerance of adventitious buds of melon were explored. The aim was to optimize the regeneration culture system of muskmelon and lay the foundation for genetic transformation of melon. The results showed that when the medium of adventitious bud was MS+1.0 mg·L-1 6-BA， the regeneration rate of muskmelon was the highest up to 92.5%. The concentration of 0.3 mg·L-1 6-BA in muskmelon was the most suitable for the growth of adventitious buds. Under the concentration of 0.7 mg·L-1 6-BA， the highest multiplication coefficient of adventitious buds was 2.33. When the concentration of Kan was higher than 20 mg·L-1， the explant was browning and could not differentiate into green buds. There was no significant difference in the effect of certain concentration of Amp on adventitious bud formation.

Key words： Melon; Adventitious buds; Regeneration; Antibiotics

甜瓜（Cucumis melo）是全國(guó)乃至全球普遍種植的一種經(jīng)濟(jì)作物，果實(shí)口感佳、營(yíng)養(yǎng)豐富、品味獨(dú)特，是一種廣受人們喜愛(ài)的食用果品[1]。大多數(shù)研究表明，植物的基因型是其器官發(fā)生的主要影響因素。隨著植物基因工程的發(fā)展，通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良甜瓜品質(zhì)成為新的研究熱點(diǎn)，這為提高甜瓜品質(zhì)和抗逆性開(kāi)辟了更加安全可靠、快捷可行的途徑[2-3]。建立甜瓜高效再生體系是遺傳轉(zhuǎn)化的基礎(chǔ)，基因型不同，其再生能力也會(huì)受到很大的影響，種間、品種之間的再生能力、再生頻率差異顯著[4-6]。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的培養(yǎng)轉(zhuǎn)化過(guò)程中，一個(gè)很重要的環(huán)節(jié)是抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)，防止農(nóng)桿菌過(guò)度增殖對(duì)植物組織細(xì)胞造成傷害和影響植株的再生，這就需要用抗生素及時(shí)有效地抑制，要求使用的抗生素在不傷害或少傷害受體材料的同時(shí)能完全抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)[7]。筆者以葫蘆科的甜瓜為試驗(yàn)對(duì)象，研究不同基因型、不同激素濃度配比及抗生素脅迫對(duì)其不定芽萌發(fā)的影響，探究其變化規(guī)律，優(yōu)化甜瓜的再生體系，為利用生物技術(shù)培育具有抗病蟲(chóng)害、抗逆性等優(yōu)良農(nóng)藝性狀的甜瓜及其他農(nóng)作物品種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試甜瓜材料T3、T4、T8、T18、T35、82ck、81×83均由齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院西甜瓜課題組提供。試驗(yàn)于2018年4—6月在齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院植物組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 方法

1.2.1 種子消毒 挑選大小均一、籽粒飽滿的種子于清水中浸泡6～8 h，種子去殼;在75%的乙醇中振蕩30 s倒出乙醇，用無(wú)菌水清洗2次，倒入0.1%氯化汞浸沒(méi)種子，均勻晃動(dòng)5～8 min;倒出氯化汞，再使用無(wú)菌水清洗 4～6次，每次約30 s;倒出里面的無(wú)菌水，種子表面的水分用無(wú)菌濾紙吸干。

1.2.2 甜瓜無(wú)菌苗培養(yǎng) 參照孔維萍等[8]的方法，將消毒的甜瓜種子在無(wú)菌環(huán)境下接入1/2 MS培養(yǎng)基中，平置，每瓶5 粒種子;暗培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)入25 ℃、1600 lx光照16 h/黑暗8 h條件下，培養(yǎng)3 d，統(tǒng)計(jì)成活率。

1.2.3 甜瓜不定芽的誘導(dǎo) 將生長(zhǎng)5 d左右的甜瓜81×83無(wú)菌苗子葉外植體接種于MS培養(yǎng)基上， 該培養(yǎng)基附加不同濃度的6-BA、NAA。在光照（1600 lx）16 h/黑暗8 h、溫度25 ℃條件下培養(yǎng)。21 d后統(tǒng)計(jì)甜瓜外植體的出愈率和出芽率。

1.2.4 甜瓜不定芽的伸長(zhǎng)及繼代增殖培養(yǎng) 將甜瓜81×83不定芽誘導(dǎo)中獲得的有效芽接入不同質(zhì)量濃度6-BA（0～0.7 mg·L-1）的培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽伸長(zhǎng)及繼代增殖培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)環(huán)境：光照（1600 lx）16 h/黑暗8 h，溫度 25 ℃。培養(yǎng)20 d后，觀察并統(tǒng)計(jì)不定芽伸長(zhǎng)及增殖情況。

1.2.5 甜瓜不定芽生根 基本培養(yǎng)基為1/2 MS培養(yǎng)基。挑選長(zhǎng)度為3～5 cm的甜瓜81×83無(wú)根苗，用手術(shù)刀切除底部多余的愈傷組織，將無(wú)根苗接入分別添加不同濃度 NAA的1/2 MS培養(yǎng)基中。每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接4株無(wú)根苗。培養(yǎng)環(huán)境：光照（1600 lx）16 h/黑暗8 h，溫度25 ℃，觀察生根情況。

1.2.6 不同基因型甜瓜子葉節(jié)不定芽發(fā)生情況 將7種不同基因型的甜瓜種子，按照前述方法進(jìn)行無(wú)菌苗培育，切取子葉節(jié)外植體，在MS+6-BA 1.0 mg·L-1培養(yǎng)基中進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。

1.2.7 抗生素對(duì)甜瓜不定芽耐受性的影響 配制前期所得的不定芽最佳培養(yǎng)基MS+6-BA 1.0 mg·L-1培養(yǎng)基，加完瓊脂煮沸后用量筒量取40 mL，倒入錐形瓶中，將瓶口封好放入121 ℃、20 min下高壓滅菌。將抗生素過(guò)濾滅菌后分別添加0、5、10、15、20、30 mg·L-1卡那霉素（Kan），0、50、100、150、200、300 mg·L-1氨芐青霉素（Amp）。選擇再生無(wú)菌苗葉片1.0 cm2葉盤(pán)接入培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種10瓶，每個(gè)瓶接4個(gè)外植體，接種完后，封口，放入光照培養(yǎng)室中進(jìn)行恒溫光照培養(yǎng)。培養(yǎng)環(huán)境：光照（1600 lx）16 h/黑暗8 h，溫度25 ℃。21 d后統(tǒng)計(jì)子葉不定芽發(fā)生情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)與分析

成苗率/%=成苗數(shù)/接種數(shù)×100;再生頻率/%=發(fā)生不定芽的外植體數(shù)/供試外植體總數(shù)×100;增殖系數(shù)/%=（新增芽數(shù)+伸長(zhǎng)芽數(shù)）/供試再生芽數(shù)×100;生根率/%=生根外植體數(shù)/供試外植體總數(shù)×100。

借助SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件，采用Duncan多重比較法進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 甜瓜無(wú)菌苗萌發(fā)

從表1可以看出，甜瓜種子的發(fā)芽率也因基因型的不同而出現(xiàn)較大的差異，成苗率為10%～93%，T35、82ck基因型的甜瓜種子發(fā)芽率均達(dá)到90%及以上，而T8基因型的甜瓜種子成苗率只有10%。出現(xiàn)此現(xiàn)象可能是由于種子狀態(tài)不佳，此基因型的種子殼大，易破，且種仁極軟，在去殼過(guò)程中遭到一定程度的破壞。

2.2 甜瓜不定芽發(fā)生

2.2.1 不同激素組合對(duì)甜瓜不定芽發(fā)生的影響 從表2中可以看出，在1.0 mg·L-1 6-BA培養(yǎng)基條件下，甜瓜不定芽再生頻率最高，達(dá)到92.5%;而分布在此質(zhì)量濃度左右的，質(zhì)量濃度較低的不定芽發(fā)生不明顯，而質(zhì)量濃度較高的會(huì)有一定的抑制作用，6-BA 0.5 mg·L-1的不定芽再生頻率較低，只有37.5%，具有較大的差異性，隨著質(zhì)量濃度的增加，不定芽的再生頻率降低，2.0 mg·L-1 6-BA不定芽再生頻率只有32.5%，低于0.5 mg·L-1 6-BA的再生頻率，說(shuō)明6-BA對(duì)于不定芽的再生頻率隨著激素質(zhì)量濃度的升高而升高，但到一定質(zhì)量濃度后，再生頻率開(kāi)始下降，有一定的抑制作用。在添加NAA 0.1 mg·L-1的4個(gè)處理中，不定芽再生頻率也在1.0 mg·L-1 6-BA時(shí)達(dá)到最高，為67.5%。從表2數(shù)據(jù)可以看出，在同等6-BA質(zhì)量濃度、添加NAA激素培養(yǎng)條件下，不定芽的出芽率明顯低于不添加NAA的培養(yǎng)基，并且在培養(yǎng)后期，少量添加NAA的培養(yǎng)基已生根。

2.2.2 不同甜瓜材料不定芽發(fā)生情況 從表3可以看出，T35的不定芽再生頻率最高，達(dá)到87.5%;T4的次之，為71.87%;T3的再生頻率為59.37%，居于第三;T18、81×83、82ck、的相對(duì)較低，分別為53.12%、50.00%和37.50%;T8的再生頻率最低，只有10.00%。7個(gè)甜瓜材料子葉外植體不定芽的發(fā)生出現(xiàn)了極性，大部分不定芽是發(fā)生在近軸切口處，而遠(yuǎn)軸切口處不定芽發(fā)生數(shù)較少。T35和T18材料的外植體在接種后，出現(xiàn)近軸端傷口變得較為寬闊，從而發(fā)生了數(shù)目極多的不定芽。

2.3 不定芽的伸長(zhǎng)及增殖培養(yǎng)

甜瓜不定芽的最適宜伸長(zhǎng)培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.3 mg·L-1+3%蔗糖+0.7%瓊脂（表4）。在這種激素質(zhì)量濃度下，不定芽生長(zhǎng)的速度最快，且沒(méi)有出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，經(jīng)15 d就可以獲得3～5 cm高且健壯的試管苗;當(dāng)激素質(zhì)量濃度逐漸升高時(shí)，發(fā)現(xiàn)新增不定芽數(shù)也逐漸增加，MS+6-BA0.7 mg·L-1條件外植體增殖系數(shù)最高，為2.33，這一結(jié)果與前期不定芽誘導(dǎo)結(jié)果相似， 6-BA質(zhì)量濃度越接近1.0 mg·L-1，不定芽發(fā)生越多。

2.4 生根培養(yǎng)

無(wú)根苗的生根情況，從表5可以看出，對(duì)照的生根率最高，達(dá)到90%，當(dāng)NAA激素質(zhì)量濃度逐漸升高時(shí)，無(wú)根苗的生根率逐漸下降，高質(zhì)量濃度的NAA對(duì)根的發(fā)生有一定的抑制作用。此試驗(yàn)得出，無(wú)激素添加的培養(yǎng)基，生根率最高。

2.5 抗生素對(duì)甜瓜不定芽耐受性的影響

2.5.1 卡那霉素對(duì)甜瓜不定芽耐受性的影響 從4種質(zhì)量濃度梯度Kan+MS+1.0 mg·L-1 6-BA的培養(yǎng)結(jié)果（表6）可以看出，甜瓜子葉愈傷組織形成受到了不同程度的影響，不定芽同樣受到了抑制;但是，添加了抗生素的培養(yǎng)基基本無(wú)污染，較好地抑制了菌的生長(zhǎng)。隨著Kan質(zhì)量濃度的增加，不定芽的發(fā)生數(shù)呈下降趨勢(shì)，當(dāng)Kan的質(zhì)量濃度達(dá)到20 mg·L-1時(shí)，外植體都發(fā)生大量的愈傷組織，但是發(fā)生不定芽的外植體很少，且不定芽數(shù)也極少;當(dāng)Kan的質(zhì)量濃度達(dá)到30 mg·L-1時(shí)，再生頻率為0。而5 mg·L-1的Kan與對(duì)照相比，再生頻率相對(duì)較高，由于對(duì)照中未添加抗生素，所以有一部分發(fā)生污染，少量的抗生素有效地抑制了菌的產(chǎn)生，間接提高了不定芽的再生頻率。

2.5.2 氨芐青霉素對(duì)甜瓜不定芽耐受性的影響 氨芐青霉素（Amp）對(duì)甜瓜不定芽再生的抑制作用不是很明顯，從表7可以得知，前4種Amp質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基中，無(wú)明顯抑制現(xiàn)象，當(dāng)氨芐青霉素質(zhì)量濃度為100 mg·L-1時(shí)，不定芽再生率最高，達(dá)到90.00%。當(dāng)外植體處于0、50、100、150、200 mg·L-1 Amp條件下培養(yǎng)時(shí)，其再生能力并沒(méi)有較大程度的差異，當(dāng)抗生素質(zhì)量濃度上升到300 mg·L-1時(shí)，外植體不定芽再生頻率明顯降低，但再生頻率仍然能夠達(dá)到50%，因此，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)可以使用氨芐青霉素作為農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的抑制劑。

3 討論與結(jié)論

由本文的結(jié)果可知，在芽誘導(dǎo)階段，甜瓜子葉外植體在不同激素質(zhì)量濃度配比的MS培養(yǎng)基上可誘導(dǎo)出不定芽叢或愈傷組織。培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L-1 6-BA時(shí)，再生率能達(dá)到92.5%，高質(zhì)量濃度的6-BA誘導(dǎo)易出現(xiàn)叢芽，這與孫天國(guó)的試驗(yàn)結(jié)果一致[9]。另外，子葉芽誘導(dǎo)時(shí)出現(xiàn)極性現(xiàn)象，即不定芽總是出現(xiàn)在子葉近軸端。對(duì)此也有許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行了研究和報(bào)道[10-11]。在芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基的選擇上，筆者采用了低質(zhì)量濃度的6-BA，發(fā)現(xiàn)將叢生芽轉(zhuǎn)接到含有0.3 mg·L-1 6-BA的改良分化培養(yǎng)基上伸長(zhǎng)效果最好，這與張慧君[12]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似。在利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化過(guò)程中，在選擇培養(yǎng)階段由于抑制農(nóng)桿菌的生長(zhǎng)而加入的抑菌素在一定程度上也會(huì)影響芽的分化和生長(zhǎng)。在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在不定芽誘導(dǎo)過(guò)程中，加入少量的抗生素可抑制菌的產(chǎn)生，試驗(yàn)結(jié)果顯示100 mg·L-1的氨芐青霉素可以抑制菌的生長(zhǎng)，一定程度促進(jìn)了不定芽的分化，質(zhì)量濃度升高至300 mg·L-1時(shí)，對(duì)不定芽的分化有一定的抑制作用，再生頻率顯著下降，因此，進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化時(shí)可以使用氨芐青霉素作為農(nóng)桿菌生長(zhǎng)的抑制劑。

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