抑制素βA（INHβA）在胃癌中過表達的臨床病理意義

徐 艷，曹 冰，沈小星，徐佳佳，許文瑤，韓飛舟

近年來胃癌在全世界的發病率及病死率均在逐年增加，我國是胃癌大國，每年全世界的新發病例，有近1/2在我國，且多數患者在確診時已處于中晚期，中晚期胃癌的預后差，5年總生存率仍低于30%[1-2]。近年來，胃癌研究領域一項重要發現是7%～43%的病例中存在HER2蛋白過表達/基因擴增，研究顯示，曲妥珠單抗聯合化療比單純化療能夠顯著延長HER2陽性的進展期胃癌患者的生存期，證明HER2陽性的胃癌患者可從曲妥珠單抗治療中獲益，從而顯著提高預后[3-4]。但HER2陽性的患者仍然面臨著曲妥珠單抗治療后的耐藥和腫瘤復發，HER2陰性的患者也無法受益于曲妥珠單抗治療[5]。故尋找新的治療和預后判斷的分子靶點仍是胃癌研究領域的一項重要課題。多項研究證實抑制素βA（nhibin βA，INHβA）在人體多種惡性腫瘤如急性髓細胞性白血病、食管癌、膀胱癌、結直腸癌等中過表達，INHβA過表達與腫瘤細胞的增殖、浸潤、轉移和化療耐受相關，INHβA過表達的腫瘤常常表現為分化程度差、臨床分期高、脈管浸潤和淋巴結轉移常見，患者預后差[6-9]。INHβA是預測胃癌發病和進展的8個重要分子學指標之一[10]。但目前關于INHβA表達與胃癌臨床病理特征的關系，以及作為潛在治療和預后判斷分子靶點的研究仍較少見。本研究通過觀察INHβA在胃癌中的表達，并分析與臨床病理參數、HER2蛋白過表達/基因擴增的關系，探討INHβA作為胃癌新的個體化治療和預后判斷分子靶點的臨床應用價值。

1 對象與方法

1.1 對象 收集東南大學附屬中大醫院病理科2013年6月—2018年6月臨床資料完整的手術切除的胃癌病例共146例，其中男89例，女57例，年齡31～79歲，中位年齡61.4歲；近端胃癌59例，遠端胃癌87例，；腸型91例，彌漫型37例，混合型18例；腫瘤分化程度：高-中分化腺癌90例，低-未分化癌56例；113例伴淋巴結轉移，33未檢測出區域淋巴結轉移；臨床分期Ⅰ期30例，Ⅱ/Ⅲ期116例。并隨機選取24例正常胃黏膜組織作為研究對照。所有病理存檔蠟塊4 μm厚切片，HE染色，光鏡下重新進行組織學分類（以2010年WHO胃癌分類標準為標準），逐一復習患者的臨床病理資料并重新進行臨床分期。采用電話或信件的方式進行病例隨訪，隨訪截止日期為2019年12月31日，隨訪時間定義為手術日至死亡或至隨訪截止日期。

1.2 組織芯片制備和免疫組化染色 光鏡下重新組織學分類的過程中確定并標記每一位患者具代表性的癌組織區域。使用組織微陣列儀（Beecher Instruments，美國）對標記的癌組織區域及正常胃粘膜進行穿刺，打孔針孔徑為1.6 mm，每個蠟塊的癌組織穿刺點不少于2個，所有標本置于空白蠟塊中并做相應記錄，制作成組織芯片蠟塊。組織芯片蠟塊5 μm厚切片，采用高溫高壓法進行抗原修復，免疫組化兔抗人多克隆抗體INHβA（abcam，中國香港）按1:100稀釋，實驗按Envision二步法進行操作。INHβA的表達判斷標準簡述如下：①根據染色強度：0分，無染色；1分，淡黃色；2分，黃色；3分，棕黃色。②根據染色陽性細胞數：0分，陽性細胞＜10%；1分，11%～50%細胞陽性；2分，51%～75%細胞陽性；3分，＞75%細胞陽性；兩項合并后結果為：0～3分為陰性或低表達（INHβA－）；4～9分為過表達（INHβA＋）。使用HercepTestTM-HER2檢測試劑盒（Dako，丹麥）檢測HER2蛋白表達，結果判斷按改良HercepTestTMHER2（Dako，丹麥）評分標準進行，具體為：0，癌細胞無染色或＜10%癌細胞胞膜染色；1＋，10%癌細胞胞膜染色隱約可見或僅有部分膜染色；2＋，10%癌細胞基底側膜、側膜或胞膜完全輕-中度染色；3＋：10%癌細胞基底側膜、側膜或完全性胞膜強染色；0和1+視為陰性（HER2－），2＋視為不確定，3+視為陽性（HER2＋）；對HER2評分為2＋～3＋的病例進一步應用熒光原位雜交（fluorescence in situ hybridization，FISH）技術進行驗證。

1.3 熒光原位雜交（FISH） FISH法檢測組織芯片中HER2基因擴增，操作流程如下：4 μm厚切片脫蠟水化后蛋白酶K37 ℃孵育30 min，脫水風干后備用。將FISH探針（安必平醫藥科技股份有限公司，中國）混合物置于（74±1）℃水浴箱變性5 min，切片滴加10 μl變性后探針混合物，加蓋蓋玻片后42 ℃溫箱中雜交過夜。切片滴加15 μl 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）復染劑，暗室內放置10～20 min，熒光顯微鏡下判斷結果。判斷標準：每張切片計數30個癌細胞核紅色HER2信號和綠色CEN17信號，計算HER2/CEN17比值，比值2.0為HER2基因擴增陽性（HER2＋），＜2.0為HER2基因擴增陰性（HER2－）。為保證檢測結果的準確性，對于比值介于1.8和2.2之間的病例，重新計數30個腫瘤細胞計算HER2/CEN17比值。

1.4 統計學處理 應用SPSS 19.0對數據進行統計分析，計數資料采用χ2檢驗或Fisher確切概率法進行比較，變量間相關性采用Spearman相關性分析。生存分析采用Kaplan-Meier法，生存率的比較采用log-rank檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 INHβA過表達 INHβA表達定位于細胞質和膜，呈棕黃色細顆粒狀（圖1）。INHβA在正常胃黏膜和胃癌的過表達率分別為12.5%（3/24）和61.6%（90/146），比較差異具有統計學意義（P＜0.01）。胃癌中INHβA過表達與腫瘤大小（P＜0.05）、分化程度（P＜0.01）、臨床分期（P＜0.05）以及淋巴結轉移（P＜0.01）相關；而與患者年齡、性別、腫瘤部位和組織學分型無相關性（P＜0.05）（表1）。

圖1 胃癌INHβA表達

2.2 HER2蛋白表達和基因擴增 免疫組化顯示28例（19.2%）呈HER2陽性（3＋）表達；47例（32.2%）HER2表達不確定（2＋）。免疫組化陽性病例中，FISH顯示存在HER2基因擴增的有24例（16.4%），HER2蛋白表達與基因擴增一致率為85.71%（24/28）（圖2）。47例HER2表達不確定病例經FISH證實均無基因擴增。在蛋白和基因水平上，HER2表達均與腫瘤的部位和組織學類型相關（P＜0.05），而與患者性別、年齡、腫瘤大小、分化程度、淋巴結轉移以及臨床分期無相關性（P＜0.05）（表1）。

表1 胃癌中INHβA過表達、HER2蛋白表達和基因擴增與臨床病理參數的關系

圖2 胃癌HER2蛋白表達和基因擴增

2.3 INHβA過表達與HER2蛋白表達和基因擴增的相關性 Spearman相關分析顯示，INHβA過表達與HER2蛋白表達和基因擴增均呈負相關（表2）。

表2 胃癌中INHβA與HER2表達的相關性

2.4 生存分析 除去9例失訪，3例死于感染、腦出血的病例，本研究共134例納入生存分析，隨訪時間18～80個月，隨訪期間56例（41.8%）死于胃癌，中位生存期為42.6個月。INHβA過表達（INHβA＋）患者總生存率顯著低于INHβA陰性及低表達（INHβA－）患者（P＜0.05），HER2＋患者總生存率略低于HER2－患者，但差異無統計學意義（P＞0.05）。根據INHβA和HER2表達情況進一步分為INHβA/HER2雙表達組（INHβA＋/HER2＋）、單表達組（INHβA－/HER2＋和INHβA＋/HER2－）和雙陰性組（HER2－/INHβA－），生存分析顯示INHβA/HER2雙表達的患者預后最差，總生存率顯著低于單表達組和雙陰性組（P＜0.01）（圖3）。

圖3 Kaplan-Meier生存曲線

3 討論

INHβA是轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）基因超家族的配體之一，INHβA與激活素A形成二硫鍵同型二聚體，共同參與調控胚胎干細胞分化和器官形成等多種重要的生理活動。近年來，多項研究發現INHβA參與腫瘤的發生、演進、臨床治療反應和預后等病理過程，多種腫瘤如急性髓細胞性白血病、食管癌、膀胱癌、結直腸癌等中存在INHβA過表達[6-9]。INHβA過表達不僅是患者預后不良的一個獨立判斷指標，還是介導腫瘤上皮-基質轉化產生化療耐受的重要機制之一。在本研究中胃癌患者中INHβA過表達率為61.6%，高于正常對照胃粘膜；INHβA過表達與腫瘤大小、分化程度、臨床分期及淋巴結轉移相關，腫瘤直徑5 cm、低/未分化、進展期（Ⅱ/Ⅲ期）及伴有淋巴結轉移胃癌中的INHβA過表達率顯著高于腫瘤直徑＜5 cm、高/中分化、早期（Ⅰ期）及無淋巴結轉移的胃癌；這提示INHβA過表達是促進胃癌生長、浸潤和轉移的重要因素。本研究顯示INHβA過表達與胃癌的部位和組織學類型無相關性，提示INHβA在參與胃癌的組織形態學方面可能不發揮重要作用。生存分析顯示，INHβA過表達的患者5年總生存率低于INHβA陰性及低表達患者，這與既往Wang[11]和Oshima[12]等的研究結果一致，表明INHβA過表達可能主要參與進展期胃癌的生長、侵襲和轉移等過程，并可以作為判斷患者預后不良的重要指標。

HER2蛋白過表達/基因擴增是胃癌最重要的分子學特征之一，ToGA和HERXO等多項臨床實驗證實曲妥珠單抗聯合化療比單純化療能夠顯著延長HER2陽性的進展期胃癌患者的生存期，目前曲妥珠單抗已經成為治療HER2陽性晚期胃癌的一線用藥。本研究結果顯示HER2蛋白陽性表達及基因擴增均主要見于近端胃癌，組織學類型多為腸型胃癌。HER2蛋白表示及基因擴增與患者的年齡、性別、腫瘤大小、分級、淋巴結轉移以及臨床分期均無顯著相關性。盡管多項研究結果顯示HER2＋的胃癌侵襲性強，患者預后較差，本研究結果顯示HER2＋胃癌患者預后略低于HER2－患者，但5年總生存率差異無統計學意義，與Grabsch等[13]和武鴻美等[14]研究結果一致。此外，本研究還首次發現INHβA過表達與HER2蛋白過表達/基因擴增存在負相關關系，即HER2＋病例中INHβA表達率較低，而HER2-病例存在INHβA過表達，根據INHβA和HER2的表達情況可以將胃癌分為雙表達（INHβA＋/HER2＋）、單表達（INHβA－/HER2＋和INHβA＋/HER2－）和雙陰性（HER2－/INHβA－）3種不同分子學類型，生存分析顯示不同類型之間的預后差異有統計學意義，INHβA/HER2雙表達的患者預后最差，總生存率低于單表達組和雙陰性組。多種惡性腫瘤中INHβA過表達使其成為潛在的治療靶點，INHβA/HER2表達的不同類型也為胃癌的個體化治療提供了新的策略，即對于INHβA－/HER2＋胃癌應首選曲妥珠單抗治療，對于INHβA＋/HER2－胃癌可以選擇靶向INHβA治療，而對于預后最差的INHβA/HER2雙表達胃癌，臨床則可以考慮雙靶點的聯合治療。

綜上所述，本研究發現胃癌中存在INHβA顯著過表達，INHβA過表達可能與胃癌的生長、浸潤和轉移有關。INHβA過表達的胃癌預后差，提示INHβA可以作為判斷預后的重要參考指標。根據INHβA和HER2的表達可以將胃癌分為3種不同的分子學類型，為胃癌的靶向治療提供了新的思路。