CC級單囊胚凍融移植周期臨床結局分析

高曉艷，徐利，葛鳳菊，祁秀娟，黃亞

(上海永遠幸婦科醫院，上海 200131)

在輔助生殖治療中，為提高妊娠率往往會通過增加移植胚胎數來實現，與此同時多胎妊娠的問題也日益凸顯。研究表明，在一定條件下，移植1枚胚胎也可獲得較好的妊娠結局[1-2]。相對于卵裂胚，囊胚培養可以進一步篩選發育潛能更好的胚胎，同時移植時囊胚與子宮內膜同步性更好，因此囊胚的移植成功率更高[3-6]，越來越多的生殖中心采用單囊胚移植的策略。CC級囊胚一般因為質量和結局差而被大多數生殖中心所丟棄[7-8]，相關性研究比較少，其臨床應用價值也存在很多爭議。本研究著重探討CC級囊胚在凍融胚胎移植(FET)中的應用價值，同時從患者年齡、囊胚級別和發育天數等多個方面來分析單囊胚FET的臨床結局，以期為單囊胚的FET策略提供依據。

資料和方法

一、研究對象

本研究回顧性分析2017年1月至2019年12月在我院接受單囊胚FET的645個周期的臨床資料。

納入標準：移植復蘇后擴張的D5、D6、D7囊胚的單囊胚FET周期。

排除標準：反復種植失敗、子宮畸形、有宮腔病變以及失訪的患者等。

所有囊胚均采用玻璃化冷凍技術進行冷凍，冷凍的囊胚均為完全擴張期囊胚。根據Gardner囊胚評分，分為兩組：CC組(142周期)和非CC組(優于CC組，503周期)。

同時，根據患者年齡，將CC級和非CC級囊胚分別細分為3個年齡亞組，即≤35歲組、36～40歲組、>40歲組；根據囊胚發育時間，將CC級囊胚細分為3個亞組，即D5、D6、D7組。

二、研究方法

1.囊胚培養與評分：患者取卵日為第0天(D0)、第1天(D1)觀察到雙原核為正常受精，培養至第3天(D3)時將胚胎轉移至囊胚培養液中，繼續觀察至第5、6、7天(D5、D6、D7)，根據囊胚形態及直徑來決定是否進行冷凍。囊胚評分結合Gardner評分標準[9]及中華醫學會專家指南共識：內細胞團(ICM)形態規則、大小均勻、融合且直徑≥60 μm為A級，ICM形態不規則、大小不均、部分融合但直徑≥60 μm為B級，ICM明顯小于正常大小且卵裂球數目極少為C級；滋養層細胞(TE)大小均勻、形態清晰且數目超過10個為A級，TE大小不均勻、部分形態清晰且細胞數目10個左右為B級，TE大小明顯不均勻、形態不清晰、數目少于10個為C級。我院冷凍標準為D5/D6囊胚直徑≥160 μm，D7囊胚直徑≥180 μm；AA～CC所有符合標準的囊胚均進行冷凍。

2.囊胚冷凍方法：囊胚冷凍前進行激光輔助孵化皺縮。操作方法根據日本KITAZATO試劑盒的標準操作程序，關閉操作臺溫度，待囊胚皺縮后放置ES液中，靜置不超過15 min，再轉入VS液中，反復混勻洗滌數次，90 s內放置冷凍載桿的前端，迅速投入液氮中，套上套管，于液氮中保存。

3.囊胚解凍方法：收到臨床醫生解凍通知方可解凍。操作方法根據日本KITAZATO試劑盒的標準操作程序，解凍前關閉操作臺溫度，將裝有囊胚的載桿從液氮迅速放入提前37℃預熱的TS液中計時1 min，轉入DS液中計時3 min，轉入WS1液中計時5 min，WS2液中自然沉降兩次后轉入提前平衡好的囊胚培養皿中。激光輔助孵化，將囊胚透明帶進行脫除，三氣培養箱中培養≥3 h，待囊胚擴張后進行移植。

4.凍融囊胚移植：采用人工周期和自然周期準備內膜。(1)人工周期內膜準備方案：月經第3天開始，口服芬嗎通(雅培，荷蘭)紅片2 mg，一日兩次，連用12 d；經陰道B超監測內膜厚度達到8 mm以上開始轉化內膜，轉化當天計為D0，開始口服芬嗎通(雅培，荷蘭)黃片2 mg，一日兩次，連用15 d，D1開始同時安琪坦(Besins，比利時)0.2 g陰道用藥，連用14 d；D5進行囊胚移植。(2)自然周期內膜準備方案：排卵日當天計為D0，D0開始口服地屈孕酮片(雅培，荷蘭)10 mg，一日3次，連用15 d；D5進行囊胚移植。

移植后10 d查血β-HCG。移植后4周進行B超檢查，子宮腔內見孕囊或原始心管搏動為臨床妊娠。臨床妊娠率=臨床妊娠周期數/移植周期總數×100%；活產率=活產周期數/移植周期總數×100%；早期流產率=妊娠12周內流產周期數/妊娠周期數×100%；早產率=早產周期數/活產周期數×100%。

三、統計學方法

采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計量資料間均數比較采用t檢驗和單因素方差分析，計數資料間比較采用卡方檢驗；P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、患者一般資料

共納入645個FET周期，患者平均年齡(34.39±4.97)歲。根據移植囊胚質量分組，CC組142個周期，非CC組503個周期。CC組年齡顯著大于非CC組(P<0.05)，兩組間其他基礎資料比較[體質量指數(BMI)、不孕年限、基礎FSH、移植日內膜厚度以及周期方案]均無統計學差異(P>0.05)(表1)。

表1 不同級別囊胚移植患者基礎資料比較[(-±s)，n(%)]

二、囊胚移植臨床結局

645個FET周期的臨床妊娠率為46.20%(298/645)，活產率為35.81%(231/645)。CC組臨床妊娠率26.76%、活產率18.31%，均顯著低于非CC組(分別為52.69%、40.76%)(P<0.001)。兩組間患者的早期流產率、早產率以及新生兒出生體重均無統計學差異(P>0.05)(表2)。

表2 不同級別囊胚移植妊娠結局比較(%)

三、不同年齡段CC級囊胚和非CC級囊胚移植妊娠結局比較

根據患者年齡分為≤35、36～40、>40歲3個亞組，分析不同年齡段CC級囊胚和非CC級囊胚移植妊娠結局。

各亞組間患者的基礎資料(平均年齡、BMI、不孕年限、基礎FSH、移植日內膜厚度)比較均無統計學差異(P>0.05)。當患者年齡≤35歲和36～40歲時，CC組的臨床妊娠率和活產率均顯著低于非CC組(P<0.05)(表3、表4)；當患者年齡>40歲時，CC組和非CC組的臨床妊娠率和活產率無統計學差異(P>0.05)(表5)。

表3 ≤35歲年齡組不同級別囊胚移植妊娠結局比較[(-±s)，n(%)]

表4 36～40歲年齡組不同級別囊胚移植妊娠結局比較[(-±s)，n(%)]

表5 >40歲年齡組不同級別囊胚移植妊娠結局比較[(-±s)，n(%)]

四、CC級囊胚移植妊娠結局的影響因素分析

根據囊胚形成時間分為D5、D6、D7共3個亞組，并根據患者年齡分為≤35、36～40、>40歲3個亞組，分析可能的影響因素。

1.囊胚形成時間：各亞組間平均年齡、BMI、不孕年限、基礎FSH水平和移植日內膜厚度均無統計學差異(P>0.05)；D5亞組臨床妊娠率顯著高于D7亞組(P<0.05)，但3個亞組組間活產率無統計學差異(P>0.05)(表6)。

表6 不同發育天數CC級囊胚移植的臨床結局比較[(-±s)，n(%)]

2.年齡：≤35歲組的臨床妊娠率顯著高于>40歲組(P<0.05)，≤35歲組和36～40歲組的活產率均顯著高于>40歲組(P<0.05)(表7)。

表7 不同年齡組CC級囊胚移植臨床結局比較[(-±s)，n(%)]

討 論

胚胎質量往往被認為是著床和妊娠的重要因素，不管是卵裂胚還是囊胚。因為低質量胚胎的妊娠率往往會低很多，所以對于反復胚胎差的患者，是否應該移植低質量胚胎還存在很大的爭議。本研究著重研究低質量囊胚(CC級囊胚)的臨床結局。結果表明，CC級囊胚的臨床妊娠率、活產率與非CC級(優于CC級)囊胚的妊娠率和活產率均存在顯著性差異(26.76% vs. 52.69%；18.31% vs. 40.76%，P<0.05)，但CC級囊胚與非CC級囊胚在早期流產率、早產率和新生兒體重方面均沒有顯著性差異，這與之前報道的研究[10-13]類似。造成這種情況的原因可能是由于低質量囊胚的非整倍體率增加[14-15]。

Li等[10]研究了102個CC級囊胚的移植結局，結果表明CC級囊胚有21.6%的臨床妊娠率和16.7%的活產率，與本研究結果相近，其研究還表明CC級囊胚著床率、臨床妊娠率和活產率均顯著低于BB級囊胚，但是兩組間生化妊娠率、異位妊娠率和流產率等均沒有顯著性差異，且兩組間新生兒的出生體重、早產率和出生缺陷等方面均沒有顯著性差異。Nakagawa等[16]、Bouillon等[17]均認為，低質量的胚胎移植出生的新生兒與高質量胚胎移植出生的新生兒相比并沒有表現出異常情況，與本研究結果類似。同時Oron等[18]研究表明移植單個質量差的胚胎，無論是卵裂胚還是囊胚，都與產科和圍產期不良結局的風險增加沒有關聯；Wintner等[19]研究表明，在同時移植2個囊胚的周期中，低質量的囊胚也不會影響高質量囊胚的妊娠結局。但是Huang等[20]則認為，低質量囊胚會顯著影響新生兒體重，使低體重新生兒的概率升高。本研究結果并不支持這一結論，可能是樣本數量差異造成的。

本研究共納入142個CC級囊胚移植周期，患者平均年齡(35.73±5.85)歲，顯著高于非CC組的患者平均年齡(34.02±4.65)歲(P<0.05)。對年齡進行分組后，發現當患者年齡≤40歲時，CC組的臨床妊娠率和活產率均顯著低于非CC組；當患者年齡>40歲時，CC組和非CC組的臨床妊娠率和活產率差異無統計學意義。年齡≤40歲時，囊胚質量更影響臨床結局，當患者年齡>40歲時，年齡對臨床結局的影響更重要，無論胚胎質量如何，其臨床妊娠率和活產率均顯著下降。當患者年齡≤35歲時，CC級囊胚的臨床妊娠率和活產率分別為36.36%和25.76%，顯著高于>40歲患者的臨床妊娠率(9.09%)和活產率(3.03%)(P<0.05)，但與36～40歲患者的臨床妊娠率(25.58%)和活產率(18.60%)沒有顯著性差異(P>0.05)。說明FET周期中，可優先選擇非CC級優質囊胚移植，CC級囊胚可作為備用移植策略，而非廢棄。

本研究顯示：當CC級囊胚是D5形成者獲得了比較滿意的結局，其臨床妊娠率和活產率分別達到了41.94%和29.03%，而D6形成的CC級囊胚的妊娠率和活產率分別為25.27%和17.58%，D7形成的CC級囊胚也有一定的臨床妊娠率(10.00%)和活產率(5.00%)。過去的十幾年來，在D6未達到囊胚冷凍標準的胚胎都是被廢棄，而最近越來越多的研究表明，D7形成的囊胚仍具有一定的臨床應用價值，有些也可形成評分很好的囊胚，整倍體率無顯著差異，新生兒也無異常[21-25]。Ueno等[26]首次提出了D7囊胚冷凍標準：直徑達到180 μm即可冷凍，其研究發現，囊胚直徑180 μm、190 μm、200 μm、210 μm和大于220 μm時，其活產率分別為9.0%、11.9%、11.5%、15.6%、20.0%和19.9%，顯著高于移植D2胚胎的結局。本中心依據Ueno等[26]提出的冷凍標準，對D7直徑達到180 μm及以上的囊胚進行冷凍，并在適宜條件下進行復蘇移植。結果表明，D7的CC級囊胚移植也有一定的臨床妊娠率(10.00%)和活產率(5.00%)。我們的結果表明，CC級別囊胚不應該直接廢棄，可留作備用，尤其是D5的CC級囊胚移植依然有較好的臨床結局；特別是對于反復胚胎質量差、無可用胚的患者，選擇CC級囊胚移植不失為一個較好的移植策略。

我們對于囊胚進行評級的目的是為了評估胚胎的相對質量和發育潛能，以期選擇最好的胚胎來達到妊娠的目的。但是囊胚的形態評級仍具有主觀性，被評為CC級并不代表沒有發育潛力，Morbeck[27]認為“C”并不意味著沒有發育潛力，囊胚評估不應該僅僅看表面形態，也應該考慮其生存能力。對于胚胎數量較少且反復胚胎差的患者，非優質卵裂胚行囊胚培養后形成的CC級囊胚還是值得冷凍，在合適條件下行復蘇移植，可獲得比較滿意的臨床妊娠率和活產率。但是鑒于本研究樣本數量有限，尤其是>40歲以上患者和D7囊胚移植的患者數量偏少，因此后期還需要大量數據的研究來進一步確認。