血卟啉單甲醚介導的光動力療法對胃癌細胞MGC-803的光動力殺傷效應

陳強 劉立鳳 高越

光動力療法（PDT）是利用腫瘤細胞的高代謝特點來治療腫瘤的一種新方法，其原理是光敏劑可以選擇性地進入腫瘤細胞并被特定波長的光激活，引起一系列光化學反應，產生單線態氧和自由基，從而殺死腫瘤細胞［1］。血卟啉單甲醚（HMME）是常用的光敏劑，其介導的PDT已廣泛應用于整形美容、細菌感染及惡性腫瘤的治療［2-4］，通過特定波長的激光來激活HMME可以產生腫瘤殺傷效應，在內窺鏡PDT治療中激光纖維通過內窺鏡活檢通道進入腔道，造成腫瘤的原位破壞而正常組織不受損傷，具有毒性局限、損傷小的特點，且反復PDT治療不易產生耐藥性［5］，目前用于胃癌的治療研究較少，本實驗旨在研究HMME-PDT對胃癌細胞MGC-803的生長抑制作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與光源 血卟啉單甲醚（凍干粉狀態）購自上海先鋒藥業有限公司，其最佳吸收光譜為630 nm［6］，胃癌細胞MGC-803系獲自哈爾濱醫科大學細胞中心，RPMI-1640培養基和胎牛血清（FBS）均購自美國Hyclone Laboratories公司，鏈霉素和青霉素均購自蘇州碧云天生物技術公司，ApoAlert Annexin V-FITC試劑盒購自美國BD生物科技公司，細胞計數試劑盒8（CCK8）購自武漢博斯特生物工程有限公司。選用的光源為二極管激光器（日本東京三洋電機株式會社），其最大輸出功率為260 mW，波長為635 nm。光通過具有0.8 mm圓柱形擴散尖端的光纖施加器分布，照射前將輸出功率調整為50 mW，并將產生的光線進行光學準直至直徑為0.8 cm的光斑尺寸。激光輸出能量用功率計仔細校準，以避免過度曝光。

1.2 細胞培養 將胃癌細胞MGC-803接種于含有10%胎牛血清、50 μg/ml鏈霉素和50 μg/ml青霉素的RPMI-1640培養基中，置于37 ℃、含有5%CO2的濕潤培養箱中進行培養，取對數生長期細胞用于實驗。

1.3 研究方法 （1）熒光檢測與光譜分析：將細胞接種于96孔板培養基中，約1×104個/孔，置于培養箱中培養24 h，細胞貼壁后，傾去原培養液，每個孔中加入一定量的HMME，并加入新的培養基，使之濃度為2 mg/L，每個孔設置四個復孔，分別孵育不同時間（0 min、30 min、60 min、90 min、120 min、150 min、180 min、210 min、240 min、270 min、300 min），采用波長405 nm、帶寬20 nm的光源照射，激發進入胃癌細胞MGC-803的HMME發出熒光，使用光纖接收發出的熒光，采用Origin7軟件進行熒光光譜分析，確定HMME的最佳孵育時間。（2）細胞形態觀察：在6孔板上培養的細胞與2 mg/L HMME孵育90 min（最佳孵育時間）后，用10 μg/ml DAPI（Hoechst 33342）染色10 min，熒光顯微鏡下觀察細胞的形態。

1.4 細胞活力測定 將胃癌細胞MGC-803與不同濃度（0 mg/L～4 mg/L）的HMME在黑暗環境下孵育90 min后，行激光照射（波長630 nm，光功率50 mW，照射距離2 cm，照射面積0.5 cm2），輸出功率為100 mW/cm2；照射時間分別為0 s、20 s、40 s、80 s，產生的光能量強度分別為 0 J/cm2、2 J/cm2、4 J/cm2、8 J/cm2。然后在每個孔中加入10 μL CCK8試劑，將細胞置于37 ℃培養箱中孵育2 h，之后立即檢測490 nm處每個孔的光密度（OD）。細胞存活率=（實驗組OD-空白對照組OD）/（對照組OD-空白對照組OD）×100%。

1.5 統計學方法 采用SPSS 17.0統計軟件。計量資料以（）表示，采用單因素方差分析及Dunnett檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HMME在胃癌細胞MGC-803中的聚集和熒光光譜分析 經2 mg/L HMME孵育90 min的胃癌細胞MGC-803 用 10 μg/ml DAPI（Hoechst 33342）染色后，核染成藍色，紅色熒光代表MGC-803細胞中聚集的HMME，見圖1a；未與HMME孵育的細胞，細胞漿未顯示紅色熒光，見圖1b。胃癌細胞MGC-803的熒光強度隨著孵育時間的增加而迅速增加，在90 min達到峰值，然后急劇下降，并在210 min時達到另一個峰值，但低于前一個峰值，提示HMME與MGC-803細胞的最佳孵育時間為90 min，見圖2。

圖1 胃癌細胞MGC-803的熒光顯微照片

2.2 顯微鏡下胃癌細胞MGC-803的形態與數量變化 未經HMME或光照射處理的胃癌細胞MGC-803呈長梭狀，邊緣銳利，見圖3a；經2 mg/L HMME介導的PDT（4 J/cm2）誘導的MGC-803細胞形態發生明顯改變，變圓、起皺甚至破裂，存活的細胞數量明顯減少，見圖3b。

圖 2 胃癌細胞MGC-803的HMME熒光光譜分析圖

圖3 胃癌細胞MGC-803的形態學變化

2.3 胃癌細胞MGC-803的存活率測定及分析 單純給予0.25 mg/L、0.5 mg/L、1 mg/L HMME孵育，未經激光照射的胃癌細胞MGC-803幾乎無明顯變化；當HMME濃度達到2 mg/L時，細胞存活率下降至（83.22±1.69）%（P=0.011）；HMME濃度達到4 mg/L時，細胞存活率進一步下降至（81.70±3.04）%（P=0.006）；HMME濃度達到8 mg/L時，細胞存活率（78.81±1.54）%下降更明顯（P=0.002）；可能是過量HMME引起的細胞毒性作用。單純用激光照射未經HMME處理過的細胞，其存活率差異無統計學意義（P＞0.05）；光強度為2 J/cm2時，細胞存活率為（94.68±2.73）%（P=0.44）；光強度為4 J/cm2時，細胞存活率為（92.62±6.22）%（P=0.48）；當光強度增加至8 J/cm2時，存活率為（92.40±6.34）%（P=0.41）下降不明顯。當與激光照射結合時，不同濃度的HMME可以實現不同程度的細胞抑制作用，即使使用最低濃度的HMME（0.25 mg/L）也可顯著降低胃癌細胞MGC-803的存活率（P＜0.01）。不同強度的光照亦存在這樣的趨勢。經4 mg/LHMME和8 J/cm2的激光處理后，胃癌細胞MGC-803的存活率幾乎降低到最小值（5.63±1.51）%。當HMME濃度達到8 mg/L，腫瘤細胞的存活率沒有再明顯降低（P=0.15）。見圖4a。

使用固定濃度的HMME作為光敏劑，不同強度的光照射對MGC-803細胞產生不同程度的生長抑制作用。研究發現，胃癌細胞MGC-803的存活率與光動力學因子B呈近似e指數衰減關系。光動力因子B=光輸出功率×照射時間×HMME濃度（B=I0×t×C）。見圖4b。

圖4 胃癌細胞MGC-803的存活率測定及分析圖。a. 與對照組比較，★P＜0.05，★★P＜0.01，NS代表差異無統計學意義；b. 實心圓表示細胞存活率，紅色曲線顯示其與光動力學參數B的指數擬合

3 討論

光動力療法（PDT）是治療胃癌的新興替代方案，基于其靶向能力強、毒性低、治療效果好等特點，有學者認為PDT是食管癌、胃癌和結腸癌患者的一線潛在療法［5，7］。光敏劑的選擇是充分發揮PDT療效的一個重要途徑，本研究使用的血卟啉單甲醚（HMME）為新開發的光敏劑，再次證明了PDT的功效，驗證了HMME順利進入MGC-803細胞。根據熒光檢測光譜的數據分析發現，MGME-803細胞中HMME在90 min時達到濃度峰值，孵育時間過長會導致細胞損傷甚至死亡，從而影響實驗結果。后續的實驗中均采取最佳孵育時間即90 min，以求在最佳時間內達到最好的治療效果。HMME必須被激光激發以產生化學反應，如產生誘導細胞凋亡的活性氧（ROS）［5］，單純使用HMME處理腫瘤細胞是沒有殺傷效應的（P＞0.05），而濃度超過2 mg/L時可單獨產生細胞毒性作用（P＜0.05），由此可證明HMME對正常細胞的低毒性作用。本實驗還發現，HMME一旦結合激光照射就會展現其高效的殺傷效應，腫瘤細胞死亡率達90%以上。PDT有三個重要元素，光輸出功率、照射時間和光敏劑濃度，前兩者的乘積可表示為光強度。實驗中MGC-803細胞的增殖能力受到顯著抑制，與光動力因子B密切相關，光動力因子B=光輸出功率×照射時間×HMME濃度（B=I0×t×C）。隨著B值在20 W·mg/L·min范圍內增加，存活細胞明顯減少，總趨勢呈指數衰減曲線。當B值達到30 W·mg/L·min時，細胞存活率幾乎達到最小值。從擬合曲線可以看出，只要B值保持恒定，通過調節光強度或HMME濃度值，均可達到幾乎相同的細胞殺傷效果。臨床上，對于合并肝腎功能不全的患者，在確保相同治療效果的情況下，可以適當降低HMME的濃度，增加光強度即通過增加曝光時間或輸出功率，可最大程度地降低肝腎損害。與其他腫瘤不同，胃腸道腫瘤通常需要內窺鏡裝置來引導PDT進入消化道，因此曝光時間也應該考慮在內，對于不能反復進行內窺鏡檢查或長時間治療的患者，需要縮短接觸時間或降低治療頻率，通過增加HMME濃度或光輸出功率以確保最佳治療，同時使得其他器官受損最小化。

綜上，HMME介導的PDT是抑制MGC-803細胞增值的有效方法，光動力因子B與細胞存活率之間的關系曲線可指導PDT的臨床應用，但還需進一步實踐評估其作用價值。