遼寧省大菱鲆源弧菌的藥物敏感性分析(上)

郭欣碩，徐小雅，黃萍萍，關 麗，羅 靳，郭 楠

(遼寧省現代農業生產基地建設工程中心，遼寧 沈陽 110032)

隨著養殖規模的擴大、養殖密度的不斷增加、飼養頻率的提高以及養殖環境質量的不斷下降，大菱鲆在養殖過程中也產生了許多疾病，例如細菌病、病毒病、寄生蟲病等。其中，細菌病是我國大菱鲆養殖中受到損害最嚴重的一類疾病，據報道，我國大菱鲆養殖各種致病菌主要有大菱鲆弧菌、遲鈍愛德華氏菌、鰻弧菌、魚腸道弧菌、溶藻弧菌、大菱鲆源副溶血弧菌等，常引起魚類的敗血癥、魚皮下出血、鱗片黏膜脫落、鰭基部充血、潰爛癥、腹水癥、腸道白濁、腸黏膜腐爛脫落等，導致魚的大量死亡，造成重大經濟損失。因此，本研究選取大菱鲆源弧菌作為研究對象，并基于微量肉湯稀釋法分析不同大菱鲆弧菌分離株的藥物敏感性，以期為大菱鲆養殖過程中的疾病預警和安全用藥及弧菌的防治提供理論參考和技術支持。

一、材料與方法

1.試驗菌株

弧菌86株，分離自遼寧某地區大菱鲆，由遼寧省現代農業生產基地建設工程中心(疫病防控實驗室)保存。菌株來源如表1所示。

表1 大菱鲆源弧菌的來源

2.細菌的培養

嚴格按無菌操作的技術要求，觀察并選取典型細菌病癥的新鮮個體，經過解剖后，將新鮮組織和典型病灶部位體液接種于兩個選擇性培養基平板上(弧菌分離培養選用TCBS培養基，愛德華氏菌的分離培養選用麥康凱培養基)，(28±1)℃連續培養18～24小時，觀測菌落形態特征，挑選疑似的單個菌落，接種于普通營養瓊脂平板上，(28±1)℃連續培養18～24小時，可得到純菌株。

3.藥敏試驗

本試驗所用藥物為我國目前允許使用的水產用抗菌類藥物：恩諾沙星、甲砜霉素、氟苯尼考、硫酸新霉素、氟甲喹、鹽酸多西環素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲噁唑/甲氧芐啶。測試所用8種抗菌類藥敏分析試劑板購自南京菲恩醫療科技公司，試劑板主要組成成分及板條設置見表2。

表2 試劑板主要組成成分及板條設置 微克/毫升

本試驗方法參照試劑板公司提供的說明書，將傳代培養基和獲得的純菌樣品混合制成0.5麥氏濃度的菌懸液，取后混入無菌生理鹽水，向陰性對照孔中依次加入200微升無菌生理鹽水，再次吸取200微升菌懸液混入無菌生理鹽水即可得到無菌樣品稀釋液。每孔分別加入200微升(陰性對照樣品除外)，將已經加樣好的藥敏分析試劑板直接放入28℃的大型恒溫培養箱中，經培養24～28小時即可讀取試驗結果。結果按照美國臨床實驗室標準研究所(CLSI)頒布的耐藥性標準以及南京菲恩醫療科技公司提供的判定標準進行判定。

二、結果與分析

1.弧菌分離培養結果

2019年4－10月，分批次從兩個定點養殖場的大菱鲆中選取具有典型弧菌病癥的個體進行活體解剖，并選取了腹水、肝、脾、腎4個病灶部位，接種于TCBS選擇性培養基和麥康凱瓊脂培養基，用以分離弧菌和愛德華氏菌。6次共采集大菱鲆樣品216份，分離培養菌株共390株，其中弧菌屬202株，采集率約占總菌株數的52%，愛德華氏菌屬31株，采集率約占總菌株數的8%。另有157株其他菌株，采集率約占總菌株數的40%。大菱鲆樣品的數量、水溫、時間、分離菌株數量詳見表3。

表3 遼寧省菌株采集及分離情況

從表3可以看出，條件致病菌的弧菌均有檢出，表明弧菌在該地區養殖的大菱鲆中廣泛存在，并隨著日期不同有所變化。在水溫較高的環境下，病害高發的6－8月，弧菌的數量明顯高于其他日期。愛德華氏菌分離到的數目相對較少，全年共分離到31株，其中在5月檢出1株、7月檢出24株、10月檢出6株，其他日期未檢出。結合當年葫蘆島大菱鲆養殖病害暴發情況及菌株鑒定結果可以得知，在水溫相對偏高且病害高發的7月，愛德華氏菌檢出的數量相對較多，愛德華氏菌可能是引起該地區當月大菱鲆發病的主要病原菌。

(待 續)