反常性痤瘡一家系NCSTN基因新致病突變報道

繆夢宇 王真真 孫樂樂 劉 紅 張福仁

1濱州醫學院，山東煙臺，264003；2山東第一醫科大學附屬皮膚病醫院(山東省皮膚病醫院,山東省皮膚病性病防治研究所)，山東濟南，250022

反常性痤瘡(acne inversa, AI)，又名毛囊閉鎖三聯征，是一種慢性、復發性、炎癥性、消耗性的皮膚毛囊疾病，1839年Velpeau等首次報道并描述，1975年Plewig等[1]提出反常性痤瘡的命名。國外報道，AI發病率從1/103～40/103不等[2]，女性多于男性，臨床表現為復發性的排出性竇道和膿腫后疤痕形成，主要好發于大汗腺區，常累及腋窩、腹股溝、肛門及生殖器等褶皺部位。吸煙、肥胖、飲酒和衣物摩擦等是該病的危險因素[3]，可伴發鱗癌、關節炎、角膜炎-魚鱗病-耳聾綜合征、克羅恩病等[4]。研究已經證實，約40%AI患者有家族遺傳史[5]，屬常染色體顯性遺傳，2010年Wang等[6]首次確定AI的致病基因為PSENEN、PSEN1和NCSTN。迄今，已報道至少18個AI家系及4例散發病例的22個致病突變位點[7,8]。本研究中，收集到1家系并通過全基因組外顯子測序和Sanger測序確定了NCSTN基因的1個新的突變位點。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 本研究的4例AI患者來自山東省的1個反常性痤瘡家系，在山東省皮膚病醫院就診，臨床表現和組織病理符合AI[7]。該家系共3代13人(圖1)，其中患者5例(1男4女)，在世患者4例，符合常染色體顯性遺傳規律。先證者，女，49歲，有34年的炎性丘疹、膿皰、膿腫和遍及背部的增生性瘢痕病史，尤其頸部較為嚴重(圖2)。既往史和個人史無特殊，父母及家系內無近親結婚。體格檢查：一般狀況良好，心肺腹未見明顯異常。皮膚科檢查：背部可見散在的凹陷性疤痕及條索狀不規則的增生性瘢痕，頸部可見囊腫、膿腫、糜爛及滲出。先證者母親(I2)、哥哥(II3)和侄女(III2)軀干部均與先證者有相似的臨床表現，先證者侄女癥狀較輕，考慮可能與該患者年齡較小有關。組織學檢查：送檢為鱗狀上皮及多量炎性肉芽組織，可見表皮角化過度、灶性角化不全，棘層增厚，真皮內膠原纖維增生，血管周圍大量急慢性炎細胞浸潤。

圖1 家系圖

圖2 2a：頸部可見糜爛、滲出、膿腫及囊腫；2b、2c：背部可見凹陷性疤痕，條索狀不規則的增生性瘢痕及散在分布的囊腫

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA提取 共收集4例AI患者，9名健康親屬及100名健康對照者的外周血5 mL。使用Biorupter(Diagenode，比利時)從外周全血DNA提取，并使用全波長紫外/可見光掃描分光光度計(NanoDrop公司，ND-8000)進行DNA含量及純度測定。研究經山東省皮膚病醫院倫理委員會批準(批準號：2014-KYKT-23)，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2.2 全基因組外顯子測序 對先證者外周血DNA進行全基因組外顯子測序。首先使用AIExome Enrichment Kit V4試劑盒(艾吉泰康生物科技北京有限公司)捕獲完整的外顯子及相鄰內含子區域,后通過Illumina HiSeq 6000平臺對基因組文庫進行高通量、高深度測序。測序得到的原始數據經FastQC v0.11.8檢測質量后，使用TRIMMOMIC v0.38軟件將數據進行修剪過濾，最終篩選出來的數據通過BWA v0.7.17軟件比對到hg19版本的參考基因組，比對好的數據用GATK v4.0.12.0軟件進行突變位點尋找，所有的突變位點用ANNOVAR進行注釋。

1.2.3 DNA測序驗證突變 根據先證者全基因組外顯子測序獲得的致病基因上突變，對收集的其他血液DNA樣本進行突變位點的Sanger測序驗證。對篩選出的突變位點所在的基因序列區域進行PCR擴增，利用網頁版BLAST軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)設計待擴增區域序列的引物序列：NCSTN-F:GGAAACACGAACTTCCGGTC，NCSTN-R: ACTTCTGTCGTGGGAACGAA，交由北京華大基因科技有限公司合成。擴增條件：94℃預變性10 min，94℃變性30 s、61℃退火45 s、72℃延伸1 min共35個循環，之后72℃延伸10 min。PCR反應產物經瓊脂糖凝膠電泳切膠純化后，直接在ABI 3500Xl Dx Genetic Analyzer測序儀(Applied Biosystems，美國)進行測序，并運用Chromas軟件與NCSTN基因參考序列進行比對。

2 結果

2.1 AI患者外顯子測序分析 注釋后的結果顯示，該患者未在已報道致病基因PSENEN和PSEN1上攜帶致病突變；在AI相關致病基因NCSTN上攜帶突變位點c.85+2T>C，該位點位于第1號外顯子與1號內含子交界處(圖3)，dbscSNV軟件預測該突變位點分值為0.99，提示該位點可導致剪切異常為有害變異。這一突變在四個公共數據庫[dpSNP142, 1000 Genomes Project, HapMap and Exome Aggregation Consortium (ExAC, http://exac.broadinstitute. org/)]中均不存在。

2.2 Sanger測序驗證突變 對家系中全部4例AI患者(I2、II3、II5、III2)、9名健康親屬(II2、II4、II6、III1、III3、III4、III5、III6、III7)以及100名健康對照者的DNA樣本進行PCR擴增，通過Sanger測序對NCSTN基因的新突變進行驗證。結果顯示，該家系的其余3例患者均攜帶同一突變(NCSTN c.85+2T>C)，家系中9名健康親屬以及100名健康對照者中均未發現該突變。

3a：I2患者1號外顯子與1號內含子交界處存在一個剪接位點突變c.85+2T>C；3b：II3患者1號外顯子與1號內含子交界處存在一個剪接位點突變c.85+2T>C；3c：II5患者1號外顯子與1號內含子交界處存在一個剪接位點突變c.85+2T>C；3d：III2患者1號外顯子與1號內含子交界處存在一個剪接位點突變c.85+2T>C；3e：正常對照序列

3 討論

反常性痤瘡以聚合性痤瘡、化膿性汗腺炎和頭皮膿腫性穿掘性毛囊周圍炎三聯特征為臨床表現。本家系的4例患者均具有典型的臨床特征，包括：(1)典型的皮損：早期深在的痛性結節或者隨后的膿腫、竇道、疤痕及簇集的黑頭粉刺；(2)典型的發病部位：腋窩、腹股溝、會陰部、肛周、臀部及乳房下褶皺部位；(3)慢性和復發性，符合AI的診斷標準[9]。

目前，反常性痤瘡的發病機制尚不明確，30%～40%的AI患者具有家族史，為常染色體顯性遺傳。2010年Wang等首先發現家族性反常性痤瘡的發病與編碼γ分泌酶不同亞基的基因發生功能性突變有關[6]。γ分泌酶是一個膜內切蛋白酶復合體，由 Nicastrin(NCSTN)、早老素1(PSEN1)、早老素增強子2(PSENEN)、前咽缺陷蛋白(Aph1)4個基因編碼的蛋白亞基組成，這些基因發生突變造成γ分泌酶單倍體合成缺陷或不足是AI發生機制之一[10]。目前已證實NCSTN、PSEN1和PSENEN基因突變會導致AI的發生[11]，其中NCSTN基因突變占81.8%[12]。NCSTN基因位于1q23.2，包括17個外顯子，是γ分泌酶最大的活性亞基，其含有高度糖基化大的細胞外結構域(extracellular domain，ECD)和單跨膜螺旋(transmembrane helice，TM)，便于識別底物蛋白N端[13]，且納卡斯楚因蛋白參與γ分泌酶的組裝、成熟及穩定，常引起AI患者NCT蛋白表達下調[14]。已有研究表明將γ分泌酶基因敲除的小鼠表現出毛囊濾泡角質化、皮脂腺萎縮以及上皮囊腫形成[15]，因此AI的發生可能通過NCSTN突變從而影響γ分泌酶的正常活性，最終造成γ分泌酶單倍體不足。不過在其他疾病中也檢測出γ分泌酶基因突變，例如白血病、乳腺癌、擴張性心肌病[16]。另外，有報道[17]稱AI患者中除了γ分泌酶組成成分基因突變外，還存在著啟動子區域PSTP1P1變異及TNF基因多態性等。

本研究在1個AI家系的1號外顯子與1號內含子交界處發現一新發剪接位點突變，即c.85+2T>C，該突變位于剪接位點處，結構域在翻譯過程中起到終止作用，檢索國內外文獻并未發現有關此位點突變的報道。我們推測此種突變可能導致NCSTN基因編碼蛋白翻譯異常或表達單倍劑量不足，引起γ分泌酶正常活性，從而影響到對表皮角質形成細胞的維持及毛囊外根鞘細胞正常增殖和分化等[18]，最終導致AI的發生。本家系中四例患者攜帶相同的突變位點，I2、II3、II5患者的病情均較重，只有III2患者的癥狀較輕，可能與該患者年齡較小有關。

綜上，本研究發現一個新發致病突變，在國內外為首次報道，豐富了NCSTN基因的突變譜系，有助于進一步探討NCSTN突變與AI之間的關系，進而為今后AI的遺傳咨詢和基因診斷提供依據。