抗增殖蛋白2在皮膚鱗狀細胞癌中的表達及其對A431細胞增殖的影響

孔曉蕓 繆 旭 張冬梅 崔恒祥 施 健 劉念念

南通大學第二附屬醫院，江蘇南通，226000

皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma, CSCC)起源于表皮或附屬器角質形成細胞，是最常見的皮膚惡性腫瘤之一，占所有皮膚惡性腫瘤的20%[1]，具有較強的遷移力和侵襲性。日光性角化病(actinic keratosis, AK)被認為是CSCC的癌前病變，鮑溫病(Bowen’s disease, BD)則是表皮全層角質形成細胞不典型增生的原位CSCC[2]，兩者均可向CSCC轉化。CSCC的病因主要包括紫外線輻射、免疫抑制、HPV感染等，目前局部外科手術為最常用的治療方法[3]，但部分患者存在復發、轉移和死亡的不良預后，并且其發病率呈逐年增加的趨勢，因此對于CSCC的治療在臨床中仍然面臨挑戰。抗增殖蛋白2(prohibitins 2, PHB2)屬于抗增殖蛋白家族，是一類高度保守并廣泛表達的蛋白，具有多種生物學功能，包括轉錄調節、維持線粒體功能、調節細胞增殖等[4]，并且在食管鱗狀細胞癌、非小細胞肺癌、乳腺癌、前列腺癌等惡性腫瘤中已有相關研究[5-8]，證實了PHB2在癌癥組織及細胞中存在差異表達，并參與多種腫瘤發生發展的生物學過程，而對于PHB2在CSCC中的研究國內外尚未見相關報道。CSCC是具有高度突變性的人類癌癥之一，其致病相關分子基礎的研究有助于我們更深入地了解并開發新的治療靶點。蛋白激酶B(protein kinase B, PKB/AKT)的過度活化是人類惡性腫瘤的常見分子特征，研究發現AKT和PHB2在細胞內定位及功能中存在重疊，參與不同腫瘤發展過程。本研究通過免疫組織化學的方法研究了PHB2在CSCC、BD、AK以及正常皮膚組織(normal tissue, NT)中的表達情況，分析其在CSCC中的表達與臨床資料的相關性，并研究了PHB2敲除對CSCC細胞A431細胞增殖的影響，對AKT的蛋白表達及其磷酸化產物水平進行分析，以初步闡述這種調控效應產生的分子機制，為CSCC的靶向治療提供可能的理論基礎。

1 材料和方法

1.1 研究對象 收集2015年3月至2020年8月南通大學第二附屬醫院皮膚科資料完整且病理診斷明確的標本蠟塊，其中AK組織17例，BD組織18例，CSCC組織40例，NT 9例，所有患者術前均未經過放療、化療或光動力等治療，記錄患者一般信息，CSCC組織病理分級為高、中、低分化，Broder分級為I至IV級：I級，未分化細胞數<25%；II級，未分化細胞數25%～50%；III級，未分化細胞數50%～70%；IV級，未分化細胞數>70%。

1.2 主要試劑 免疫組化試劑盒(#SP-9000,北京中杉金橋)，人CSCC細胞株A431(#ZQ0043，上海中喬新舟)，兔抗人PHB2多克隆抗體(#12295-1-AP，武漢Proteintech)、鼠抗β-actin抗體(#20536-1-AP，武漢Proteintech)，CCK8試劑盒(#PF00004，武漢Proteintech)，AKT抗體(#9272s，美國CST)，p-AKT抗體(#4060L，美國CST)，DMEM培養基(#C11995500BT，美國Gibco)，0.25%胰蛋白酶(#25200-056，美國Gibco)，胎牛血清(#A511-001，烏拉圭lonsera)，100 U/mL青霉素和100 g/L鏈霉素雙抗(#C0222，江蘇碧云天)、蛋白上樣緩沖液(2×)(#P0015B，江蘇碧云天)、化學發光試劑盒(#P0018S，江蘇碧云天)、嘌呤霉素(#ST551，江蘇碧云天)，PAGE凝膠快速制備試劑盒(#PG113，上海雅酶)，Lipofectamine 2000試劑(#11668019，美國Invitrogen)，質粒小提試劑盒(#D6943-03，美國Omega)，膠回收試劑盒(#D0056，江蘇碧云天)，EcoRI限制性核酸內切酶(#R3101S，美國Biolab)，CutSmart Buffer(#B7204S，美國Biolab)，6xDNA上樣染料(#R1161，美國Thermo Scientific)，T4 DNA連接酶(#D2011A，日本Takara)。人胚腎細胞HEK293T、感受態細胞DH5α、慢病毒載體系統lentiCRISPR v2、psPAX2、pMD2.G均為本實驗室保存。

1.3 主要儀器 切片機(RM2245，德國Leica)，烘片機(HI1220，德國Leica)，攤片機(HI1210，德國Leica)，離心機(5424R，德國Eppendorf)，電熱恒溫鼓風干燥箱(DK-500S，上海精宏)、電熱恒溫水浴箱(DK-500S，上海精宏)，顯微鏡(ECLIPSE Ni-U，日本Nikon)，蛋白電泳儀(PowerPac Basic Power Supply，美國BIO-RAD)，凝膠采集成像系統(Chemi Doc MP，美國BIO-RAD)、PCR儀(T100，美國BIO-RAD)，電熱恒溫細胞培養箱(HERACELL 240i，美國Thermo Scientific)，微量分光光度計(Nanodrop one，美國Thermo Scientific)，搖床(TS-92，江蘇其林貝爾)，恒溫金屬浴儀(#K30，北京佳源興業)，震蕩培養箱(ZQZY-85CN，上海知楚)，多功能微孔板檢測儀(H1M，美國Biotek)。

1.4 實驗方法

1.4.1 免疫組織化學染色 切片機切取4 μm厚石蠟組織切片，粘貼于載玻片上，60℃烘箱烘片30 min，經松節油、梯度濃度酒精脫蠟后于檸檬酸鹽溶液中進行高壓抗原修復，冷卻后PBS沖洗3次，滴加過氧化物酶封閉30 min，PBS沖洗3次，甩干后滴加PHB2抗體，4℃濕盒孵育過夜，次日室溫復溫1 h，滴加二抗，37℃烘箱放置30 min，PBS沖洗3次，DAB顯色，蘇木素復染，鹽酸乙醇分化，自來水沖洗，經梯度濃度酒精脫水、松節油透明，中性樹膠封片。

1.4.2 判讀方法 免疫組織化學結果采用半定量評分法。將染色后的切片置于顯微鏡下觀察，在40倍物鏡下隨機挑選5個視野，計數陽性細胞百分比(<25%為1分、25%～50%為2分、51%～75%為3分、>75%為4分)及染色強度(無色為0分、淡黃色為1分、黃色為2分、棕黃色或棕色為3分)，兩者乘積即為其免疫組織化學評分，按其評分分為陰性(-，0～3分)，弱陽性(+，4～6分)，陽性(++，7～9分)，強陽性(+++，10～12分)。其中陰性、弱陽性表達按低表達計，陽性、強陽性表達按高表達計。

1.4.3 gRNA設計 利用NCBI獲得PHB2完整基因序列，利用CRISPER線上設計工具依據設計原則[9]，最終選擇該基因的299 bp及320 bp起始的序列作為sgRNA構建兩組敲除PHB2-sgRNA表達質粒。設計序列分別為：sgRNA-KO299 5'-GGGAGATATTCACCATCTGT-3'；sgRNA-KO320 5'-TGGGTCGAGACAACACTCGC-3'。開始堿基不是G，則在最前加入堿基G，在正向序列前加入堿基CACC，在反向序列前加入堿基AAAC。

1.4.4 表達載體構建 由擎科生物公司合成sgRNA，將引物經過退火后，形成具有黏性末端的雙鏈DNA，利用EcoRI核酸內切酶得到酶切產物，經凝膠電泳鑒定、膠回收，得到gRNA/cas9質粒與雙鏈DNA進行連接，連接產物轉化大腸桿菌，搖菌、培養獲得單克隆，質粒小提試劑盒提取重組質粒獲得重組表達載體lentiCRISPRv2-PHB2-KO。

1.4.5 細胞培養 將A431細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養液中，放入37℃、5% CO2的培養箱中，定期換液。

1.4.6 嘌呤霉素濃度篩選 在6孔板內每孔種1.5×105個293T細胞，次日起更換按照濃度梯度(0.4 μg/mL、0.6 μg/mL、0.8 μg/mL、1.0 μg/mL、1.2 μg/mL、1.5 μg/mL)制備的含有嘌呤霉素的完全培養基，將3天后細胞全部死亡的劑量作為嘌呤霉素篩選濃度。

1.4.7 細胞轉染 取對數生長期293T細胞移植于培養皿中，待細胞生長至融合度達80%以上時，轉染按照Lipofectamine 2000操作說明，將慢病毒gRNA/cas9載體(Addgene-52961，Zhangfeng Lab)包裝質粒psPAX2和pMD2.G一起轉染到293T細胞中，6～8 h后換液。

1.4.8 細胞感染及篩選 取對數生長期A431細胞移植于培養皿中，待細胞生長至融合度達40%～50%時，開始進行感染。293T細胞轉染48 h后，用0.45 μm分離的濾器過濾，收集含病毒上清，每個10 cm培養皿中加10 mL含病毒上清液，加入嘌呤霉素(根據預實驗最佳篩選濃度1.0 μg/mL)進行藥物篩選。

1.4.9 CCK8細胞計數實驗 取感染篩選后A431細胞(PHB2敲除組與對照組)分別移植于96孔板，細胞數為3000個/孔，繼續培養24 h，每孔加入10 μL CCK8溶液，培養箱內孵育2 h，酶標儀測定450 nm處的OD值。實驗重復3次。

1.4.10 細胞克隆形成實驗 取感染篩選后A431細胞(PHB2敲除組與對照組)分別移植于35 mm培養皿，細胞數為50個/皿，繼續培養2周，肉眼觀察培養皿中出現克隆后中止培養，棄去培養基，PBS洗滌，4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色，計算克隆形成數。實驗重復3次。

1.4.11 免疫印跡檢測蛋白表達 取蛋白質樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉膜，脫脂奶粉封閉，膜使用相應一抗4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，加入二抗室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，暗室顯影，采用Image J分析軟件處理，測定各組蛋白條帶灰度值，以目的條帶和內參條帶的比值作為蛋白表達水平(或p-AKT和AKT條帶的比值)。每個蛋白樣品重復3次。

2 結果

2.1 PHB2在CSCC、BD、AK及NT組織中的表達情況 免疫組織化學染色結果顯示，PHB2的表達定位大多位于細胞核，少量定位于胞質中。在NT中PHB2少量表達于表皮基底層細胞中，在AK中主要表達于基底層及棘層中下1/3細胞的細胞中，在BD中主要表達于表皮全層非典型性增生角質形成細胞中，在CSCC中主要在鱗狀細胞癌巢中彌漫表達(圖1a)。根據陽性細胞百分比及染色強度進行免疫組化組織學評分，并把陽性、強陽性表達定義為高表達，PHB2在CSCC、BD、AK及NT組織中的高表達率依次為90.00%、66.70%、41.18%、0.00%(圖1b)，可見PHB2的表達在四組之間呈現逐漸遞增的表達趨勢，有統計學差異(P<0.01)，見表1。接下來對兩兩組間進行表達強度比較，結果提示AK與NT、BD與NT、CSCC與NT以及AK與CSCC之間表達強度差異有統計學意義(P<0.05)，說明了PHB2在CSCC、BD、AK組織中的表達均顯著高于NT組織，并且CSCC組織中的表達顯著高于AK組織，見表2。

1a：免疫組化結果(SP法，×400)；1b： PHB2在四組中的高表達率

表1 PHB2在NT、AK、BD、CSCC組織中的表達差異

表2 PHB2在NT、AK、BD、CSCC組織中的表達強度比較

2.2 PHB2在CSCC中的表達與臨床病理參數相關性 PHB2表達與性別、年齡、部位、病程、腫瘤直徑、浸潤深度、分化、Broder分級等臨床病理資料均無顯著相關性(P>0.05)，見表3。

表3 CSCC組織標本中PHB2的表達與臨床特征的關系

2.3 構建PHB2敲除的CSCC細胞A431細胞 運用CRISPR-Cas9系統構建了兩組靶向敲除PHB2的CSCC A431細胞(KO299組以及KO320組)，以空載體轉染的NC組為對照細胞。Western印記結果顯示，NC組與KO299組PHB2與內參β-actin比率為1.478±0.276和0.461±0.165，t=5.485，P<0.01；NC組與KO320組PHB2與內參β-actin比率為1.565±0.413和0.658±0.070，t=3.752，P<0.05，均有統計學差異，驗證了PHB2的敲除效果，見圖2。

圖2 Western印跡法分析PHB2蛋白在敲除組與對照組細胞中的表達情況(***，P<0.05)

2.4 PHB2敲除對CSCC細胞A431細胞增殖的影響 通過CRISPR-Cas9法構建了兩組靶向敲除PHB2的CSCC細胞A431細胞模型(KO299組以及KO320組)，以空載體轉染的NC組為對照細胞。CCK8細胞增殖實驗結果顯示，細胞培養24 h后，NC組細胞相對活力為0.996±0.144，兩組敲除組中，KO299組細胞相對活力為0.339±0.023，與NC組比較A431細胞活力顯著下降，t=7.820，P<0.01；KO320組細胞相對活力為0.475±0.079，與NC組比較A431細胞活力顯著下降，t=5.502，P<0.01，見圖3。細胞克隆形成實驗結果顯示，細胞培養2周后，NC組細胞克隆形成數為139.333±24.947，兩組敲除組中，KO299組細胞克隆形成數為41.667±5.132，與NC組比較細胞克隆形成數顯著下降，t=6.642，P<0.01；KO320組細胞克隆形成數為42.667±9.292，與NC組比較細胞克隆形成數顯著下降，t=6.290，P<0.01，見圖4。

圖3 CCK8細胞增殖實驗驗證PHB2敲除對A431細胞增殖的影響(***，與NC組比較P<0.01)圖4 細胞克隆形成實驗驗證PHB2敲除對A431細胞增殖的影響(***，與NC組比較P<0.01)

2.5 PHB2敲除對AKT蛋白磷酸化的影響 Western印跡結果驗證了NC組與KO299組之間的p-AKTSer473/AKT比率分別為1.319±0.283和0.387±0.081，t=5.472，P<0.01；NC組與KO320組之間的p-AKTSer473/AKT比率分別為1.383±0.242和0.648±0.031，t=5.221，P<0.01，初步說明了p-AKT表達隨PHB2表達水平的降低而顯著下調，見圖5。

圖5 Western印跡法分析PHB2敲除對A431細胞AKT蛋白表達及其ser473位點磷酸化產物水平的影響(***，P<0.01)

3 討論

抗增殖蛋白家族包括PHB1以及PHB2，均在生物體細胞內分布廣泛，包括細胞核、線粒體和細胞質，不同的亞細胞定位使其表現出獨特的生物學功能，在調節轉錄、核信號傳導、維持線粒體結構與功能、細胞增殖與凋亡中產生重要作用，在癌癥、神經肌肉病變和其他代謝性疾病等病理過程中發揮關鍵調節因子的作用[10-12]。目前，PHB2對于腫瘤的調控機制尚存在爭議，一種解釋是腫瘤細胞通過提高線粒體呼吸作用維持能量代謝，導致線粒體受到氧化損傷，而線粒體中PHB2的增加提高了腫瘤細胞線粒體的穩定性，另一種解釋則是細胞核定位的PHB2可以直接或間接調節轉錄因子，調控腫瘤細胞增殖、凋亡、細胞周期等[4]。來自癌癥基因組圖譜和人類蛋白質圖譜的數據表明，PHB2在食管鱗癌、前列腺癌、非小細胞肺癌等腫瘤中均在mRNA和蛋白質水平上廣泛表達，促進相關腫瘤的發生發展。

在食管鱗狀細胞癌中，2018年Cai等[5]對229例患者通過免疫組織化學證實了腫瘤組織中的PHB2表達明顯高于癌旁組織，臨床病理特征中，PHB2的表達與年齡、性別、腫瘤分化、TMN分期等因素無關，高水平的PHB2表達與總生存期相關，提示PHB2的低表達可能提高了食管鱗癌患者的總生存期。本研究中，我們對CSCC、BD、AK組織石蠟切片進行免疫組織化學染色，觀察到了PHB2主要的胞核以及少量胞質定位，在CSCC癌巢細胞中呈現彌漫表達，其表達與正常組織之間有顯著差異。此外，AK及BD作為臨床上有可能向CSCC演化的疾病，其組織中PHB2表達也高于正常組織。在臨床病理資料方面，我們結果表明PHB2與年齡、性別、腫瘤直徑及分化程度等臨床病理特征沒有顯著相關，我們推測其可能原因是PHB2與CSCC的發生相關，而不參與其惡性發展，需后期擴大樣本量進一步證實。

PHB2在許多腫瘤細胞如食管鱗癌、乳腺癌、前列腺癌等中高表達[5,7,8]，在肝細胞癌細胞中，PHB2的表達在腫瘤早期上調，而在晚期表達下調[13]。在細胞生物學功能方面，已有研究通過siRNA建立PHB2敲減的食管鱗癌細胞模型，細胞計數和transwell實驗證實了PHB2的敲減可以抑制腫瘤細胞的增殖和侵襲能力[5]。在2017年Shen等[8]對前列腺癌的研究中，以siRNA干擾PHB2表達，通過細胞劃痕及transwell實驗證實了PHB2的表達敲減可以抑制腫瘤細胞的遷移。在CSCC中，通過CCK8細胞增殖實驗和細胞克隆形成實驗，我們同樣發現PHB2敲除后，A431細胞的增殖能力顯著降低，此結果初步證實了PHB2與CSCC的發生相關。

AKT是PI3K/AKT信號轉導通路中重要的蛋白激酶，為PI3K下游的靶分子之一，Ser473是其主要的磷酸化位點之一[14]，其在細胞存活和凋亡中起重要作用，研究證實，AKT相關通路的激活在CSCC發生發展中起重要作用[15]。值得注意的是AKT和PHB2在細胞內定位以及調節細胞功能過程中存在一些重疊，表明它們之間可能存在潛在的功能相關性。在食管鱗癌中，PHB2通過增加p-AKT的表達促進了腫瘤細胞的增殖和轉移[5]。在前列腺癌中，已有研究證實了PHB2可能通過抑制AKT2的表達來促進腫瘤細胞遷移[8]。在CSCC的A431細胞中，我們的研究發現，PHB2敲除抑制了腫瘤細胞增殖能力，并且p-AKT表達顯著降低，因此，PHB2可能通過調節AKT蛋白活化從而影響CSCC的發生。

綜上所述，PHB2在CSCC組織中較正常組織表達上調，可能與CSCC的發生相關。此外，PHB2可以促進CSCC腫瘤細胞增殖，其機制可能與促癌基因AKT蛋白活化相關。本研究為CSCC的治療靶點提供了理論基礎，但需進一步擴大臨床樣本量、就分子機制進行更加深入的研究，為設計具有臨床價值的治療CSCC的靶向藥物奠定基礎。