白芍總苷聯(lián)合NB-UVB對(duì)中重度銀屑病血清IL-17、IL-23和皮損PAR-2表達(dá)的影響

任國(guó)華 趙 瑩

菏澤市立醫(yī)院皮膚科，山東菏澤，274013

銀屑病發(fā)病機(jī)制不清，目前認(rèn)為與遺傳、環(huán)境和免疫等多因素相關(guān)，由先天性免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)介導(dǎo)，是一個(gè)累及多環(huán)節(jié)多通路的疾病。既往研究發(fā)現(xiàn)T淋巴細(xì)胞的失常及Th1細(xì)胞的過(guò)度活化和銀屑病發(fā)病相關(guān)。白介素(IL)-23可以激活、活化輔助性淋巴細(xì)胞，更重要的是可以促進(jìn)IL-17分泌，而且研究還發(fā)現(xiàn)IL-23水平升高可以通過(guò)IL-17/IL-23的免疫應(yīng)答途徑，從而增加IL-17水平的表達(dá)，進(jìn)一步刺激銀屑病發(fā)病與進(jìn)展[1]。蛋白酶活化受體2(PAR-2)廣泛分布于人體內(nèi)各種組織和細(xì)胞，角質(zhì)形成細(xì)胞以及血管內(nèi)皮細(xì)胞是其主要效應(yīng)細(xì)胞。它介導(dǎo)皮膚中多種功能，包括皮膚炎癥和屏障功能調(diào)節(jié)等。因此PAR-2的前炎癥效應(yīng)有可能成為治療皮膚炎癥的一個(gè)新的靶位。

白芍總苷(total glucosides of paeony，TGP)是從白芍中提取出來(lái)的有效成分，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗病毒、保肝以及多途徑抑制自身免疫反應(yīng)等多種藥理作用[2]。本研究通過(guò)觀察白芍總苷聯(lián)合窄譜中波紫外線(NB-UVB)對(duì)中重度銀屑病患者的治療效果，并研究治療前后患者血清中IL-17、IL-23表達(dá)變化，以及皮損組織蛋白酶活化受體2表達(dá)的變化，了解其對(duì)銀屑病患者的治療效果，以及可能的治療機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇 2019年5月至2020年6月來(lái)我院皮膚科就診的中重度銀屑病患者90例，其中男50例，女40例，年齡12～75歲，平均(43.38±9.67)歲。由同一位醫(yī)師進(jìn)行評(píng)估入組患者的銀屑病嚴(yán)重程度指數(shù)(PASI)評(píng)分[3]。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)通過(guò)臨床醫(yī)師診斷或組織病理學(xué)診斷為銀屑病；(2)就診前3個(gè)月內(nèi)，未接受過(guò)糖皮質(zhì)激素類、阿維A類、免疫抑制劑類等藥物治療；(3)PASI評(píng)分均≥10分。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有心肝腎功能不全；孕婦及年老體弱自理能力差；光敏感或者有光敏性相關(guān)疾病；近1個(gè)月內(nèi)服用光敏性藥物；依從性差、未完成治療及隨訪者。所有患者皆簽署知情同意書(shū)。所有中重度銀屑病患者隨機(jī)分為三組，NB-UVB治療組、白芍總苷治療組、白芍總苷聯(lián)合NB-UVB治療組，各30例。三組年齡病程和PASI評(píng)分無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。選擇健康查體者30名為正常對(duì)照。

1.2 方法

1.2.1 治療方法 NB-UVB治療組：采用窄譜中波紫外線光療儀進(jìn)行治療(上海Sigma公司，ss-05)，波長(zhǎng)為310～315 nm，峰值311 nm，全身照射。照射起始劑量為0.4 J/cm2,依據(jù)治療反應(yīng)，后續(xù)治療劑量在前次治療劑量基礎(chǔ)上依次增加10%～20%，3次/周(至皮膚紅斑反應(yīng)維持劑量)。白芍總苷治療組：白芍總苷口服膠囊治療，600 mg/次，日3次。聯(lián)合治療組：為上述兩組的聯(lián)合治療。療效觀察時(shí)間為3個(gè)月。

1.2.2 ELISA檢測(cè) 正常對(duì)照者、所有患者治療前及治療后3個(gè)月，分別于清晨采集空腹靜脈血5 mL，以3000 r/min的速度離心20 min，分離上層血清，所有標(biāo)本放置于-70℃冰箱中保存，統(tǒng)一進(jìn)行檢測(cè)。IL-17、IL-23的表達(dá)采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)行檢測(cè)。嚴(yán)格按照IL-17、IL-23試劑盒(上海雅吉生物科技有限公司)說(shuō)明進(jìn)行相應(yīng)的操作，每個(gè)檢測(cè)孔設(shè)2個(gè)副孔，于波長(zhǎng)450 nm處測(cè)吸光度(A)值。

1.2.3 皮膚標(biāo)本制備 部分患者在治療前及治療后3個(gè)月軀干或四肢典型皮損處，用環(huán)鉆切取直徑大約4 mm全層皮損；正常對(duì)照組的性別、年齡及取材部位與患者相匹配，來(lái)自色素痣等非炎癥皮膚，選取軀干或四肢外科手術(shù)切口邊緣正常皮膚。所有皮膚組織置于4%甲醛固定液中固定。

1.2.4 皮損處PAR-2組化進(jìn)行DAB染色 固定后的皮膚組織制成石蠟切片，并進(jìn)行連續(xù)切片。整個(gè)流程如下：首先將切好的切片放于60℃烘箱中1 h至石蠟切片融化，依次放入100%的二甲苯、不同濃度的酒精脫蠟浸水，再加入3%雙氧水以清除標(biāo)本的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性。使用抗原修復(fù)液修復(fù)抗原后，經(jīng)透膜、封閉后依次加入適當(dāng)稀釋的一抗、二抗、DAB顯色、蘇木素復(fù)染。

1.2.5 療效判定 詳細(xì)記錄銀屑病患者的紅斑、浸潤(rùn)、部位以及皮損的面積大小，在治療前和治療后3個(gè)月分別進(jìn)行 PASI 評(píng)分。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，符合正態(tài)分布的連續(xù)型變量?jī)山M之間的比較使用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組資料則進(jìn)行方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療前、后各組患者的PASI評(píng)分比較 三組治療前PASI評(píng)分比較,無(wú)顯著差異。而治療后，三個(gè)治療組PASI 評(píng)分均顯著低于治療前(P<0.05)。同時(shí)，經(jīng)過(guò)治療后，聯(lián)合治療組PASI 評(píng)分顯著低于白芍總苷組和NB-UVB組(P<0.05)，而后兩組之間PASI 評(píng)分無(wú)顯著差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 治療前后各組患者PASI 評(píng)分比較分)

2.2 治療前后尋常型銀屑病患者血清IL-17、IL-23表達(dá) 各組治療前血清IL-17、IL-23水平均高于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，三組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。經(jīng)3個(gè)月治療后，三組血清IL-17、IL-23水平與正常對(duì)照相比無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。三組治療后血清IL-17、IL-23水平均顯著低于治療前，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 見(jiàn)表2。

表2 各組治療前后銀屑病患者血清IL-17、IL-23水平比較

2.3 觀察組前后皮損PAR-2表達(dá)情況與正常皮膚比較 治療前可見(jiàn)表皮棘層增厚，上皮腳延長(zhǎng)，表皮全層細(xì)胞膜及胞質(zhì)可見(jiàn)較多PAR-2陽(yáng)性棕黃色細(xì)顆粒狀均勻分布。治療后可見(jiàn)表皮厚度接近正常，表皮全層細(xì)胞膜及胞質(zhì)可見(jiàn)部分PAR-2陽(yáng)性棕黃色細(xì)顆粒狀分布。見(jiàn)圖1。

1a：正常對(duì)照組可見(jiàn)PAR-2在表皮全層，以及毛囊、汗腺、血管內(nèi)皮細(xì)胞均有陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性呈胞膜及胞質(zhì)棕黃色；1b、1c:NB-UVB組治療前后皮損PAR-2表達(dá)情況；1d、1e:白芍總苷組治療前后皮損PAR-2表達(dá)情況；1f、1g:聯(lián)合治療組治療前后PAR-2表達(dá)情況。

2.4 各治療組治療前后皮損PAR-2染色的平均吸光度比較 各組治療前皮損PAR-2染色的平均吸光度高于正常對(duì)照組，而治療后與正常對(duì)照組無(wú)顯著差異(P>0.05)，而治療前各組比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，三組治療后，聯(lián)合治療組平均吸光度低于兩個(gè)單獨(dú)治療組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組治療前后角質(zhì)形成細(xì)胞PAR-2染色的平均吸光度

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)銀屑病患者皮損角質(zhì)形成細(xì)胞異常分化和增殖是受免疫系統(tǒng)刺激，尤其是局灶性皮損的T淋巴細(xì)胞。真皮髓樣樹(shù)突狀細(xì)胞分泌的IL-12及IL-23等炎性因子可以誘導(dǎo)Th17細(xì)胞的活化，后者釋放致炎的Th1細(xì)胞因子。同時(shí)Th1和Th22輔助性T細(xì)胞分泌大量的TNF-α、IL-22、IFN-γ、IL-17等銀屑病相關(guān)細(xì)胞因子。這些炎癥因子介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)對(duì)銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖造成影響[4,5]，而角質(zhì)形成細(xì)胞是銀屑病發(fā)病過(guò)程中極其重要的細(xì)胞。

IL-23/IL-17軸水平在銀屑病的發(fā)病中起著關(guān)鍵性的作用，對(duì)與該軸相關(guān)的細(xì)胞因子進(jìn)行蛋白水平以及mRNA水平表達(dá)的抑制，并調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞相關(guān)的分化，有效控制轉(zhuǎn)錄因子RORγt及STAT3-mRNA等的表達(dá)，有可能成為銀屑病治療的新靶點(diǎn)[6,7]。

NB-UVB照射皮膚可引起一系列復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng)，包括對(duì)朗格漢斯細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(NK)、尿甘酸等的影響[8]。研究發(fā)現(xiàn)NB-UVB能降低銀屑病患者皮損Th1細(xì)胞的活性，抑制T細(xì)胞生成并加速其凋亡，減少皮損T細(xì)胞浸潤(rùn)，抑制NK細(xì)胞的功能，降低患者血清中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子水平，從而減輕患者表皮炎癥反應(yīng)[9]。

白芍總苷屬于一種糖苷類分子，由天然芍藥提取而來(lái)，其藥理作用廣泛，具有雙向性多途徑調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)作用。包括保肝護(hù)腎、調(diào)節(jié)脂代謝、止痛、抗炎、等多種作用。銀屑病患者機(jī)體內(nèi)T淋巴細(xì)胞被激活后會(huì)產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)，造成Th1/Th2和Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞失衡[10]。而白芍總苷可通過(guò)其抗炎和調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫功能的作用機(jī)制，使T細(xì)胞達(dá)到平衡狀態(tài)[11]，并影響B(tài)淋巴細(xì)胞生長(zhǎng)增殖，拮抗局部炎癥因子的合成與分泌，達(dá)到高效抗炎目的。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)白芍總苷可明顯抑制永生化的人角質(zhì)形成細(xì)胞株(HaCaT細(xì)胞)分泌因子[12]，進(jìn)而調(diào)節(jié)銀屑病患者的免疫狀態(tài)。

本研究結(jié)果顯示通過(guò)3個(gè)月治療，三組PASI評(píng)分都顯著低于治療前。NB-UVB治療組和白芍總苷治療組療效比較無(wú)明顯差異，治療后聯(lián)合治療組PASI評(píng)分顯著低于NB-UVB和白芍總苷單獨(dú)治療組。說(shuō)明聯(lián)合治療組比單獨(dú)治療組在中重度銀屑病的病情上治療時(shí)間短，病情減輕快。

與正常對(duì)照組比較，三組血清IL-17、IL-23水平明顯增高。而經(jīng)過(guò)三個(gè)月治療，三組患者血清IL-17、IL-23水平都降低，說(shuō)明白芍總苷及NB-UVB治療都可以有效降低炎性細(xì)胞因子水平，對(duì)治療銀屑病都有良好效果。蛋白酶激活受體屬于7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體家族，其中PAR-2在組織和細(xì)胞中分布廣泛，其在某些病理狀態(tài)下表達(dá)可以顯著上調(diào)或下調(diào)。皮膚的角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮血管內(nèi)皮細(xì)胞是PAR-2的主要效應(yīng)細(xì)胞[13]，介導(dǎo)皮膚中的多種功能，包括皮膚炎癥和皮膚屏障功能調(diào)節(jié)等。研究發(fā)現(xiàn)在典型的炎癥性皮膚病如特應(yīng)性皮炎和銀屑病皮損中，角質(zhì)形成細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞PAR-2的表達(dá)顯著增加[14]。由此看來(lái)，PAR-2的前炎癥效應(yīng)有可能是治療各種皮膚炎癥的一個(gè)新的靶點(diǎn)。

治療前病灶區(qū)皮膚較厚，PAR-2陽(yáng)性表達(dá)較多，在胞膜、胞質(zhì)呈棕黃色細(xì)顆粒狀均勻分布。三組治療前PAR-2表達(dá)均無(wú)明顯的差別，通過(guò)治療后，聯(lián)合組比其他兩組比較，皮膚厚度明顯變薄，接近正常皮膚。PAR-2陽(yáng)性表達(dá)較少，棕黃色顆粒雖然仍呈胞膜、胞質(zhì)均勻分布，但顆粒明顯變小。但是三組相比較，聯(lián)合組與其他兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。進(jìn)一步說(shuō)明白芍總苷聯(lián)合紫外線治療組的治療機(jī)制有可能和治療后中重度銀屑病皮損內(nèi)角質(zhì)形成細(xì)胞PAR-2表達(dá)降低有關(guān)。

綜上所述，應(yīng)用白芍總苷聯(lián)合NB-UVB治療中重度銀屑病較單獨(dú)NB-UVB與白芍總苷治療效果更佳，可促進(jìn)患者皮損恢復(fù)時(shí)間快，減輕病情，安全有效，不良反應(yīng)少，大幅度提高了患者的生活質(zhì)量，值得在臨床中推廣使用。