中山地區淋球菌頭孢菌素敏感性及NG-MAST研究

陸善詞 梁 棟 梁連輝 高文軍 蔡常輝

中山市第二人民醫院,中山,528447

目前，注射用頭孢曲松和口服頭孢克肟是全球大多數國家和地區用于治療淋病的一線藥物。因抗生素的濫用和市場監管不足，以及淋球菌易獲取外源性耐藥基因的特性，近年來，多個國家出現對頭孢曲松高度耐藥的淋球菌株，甚至出現口服頭孢菌素類藥物治療淋病失敗的病例[1,2]。NG-MAST基因分型技術是一種可監測特殊菌株的暴發流行、耐藥性及菌株進化等情況的有效方法[3,4]。本研究目的是探討中山市轄區淋球菌對頭孢曲松、頭孢克肟的耐藥性及分子流行病學特征，為臨床治療及預防提供依據。現將結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 菌株收集及藥敏試驗 淋球菌收集于2017年5月至2018年10月中山市12個淋球菌耐藥監測點共193株，菌株經過分離培養、鑒定和純化后用10%小牛血清保存管凍存于-70℃低溫冰箱中。淋球菌基礎培養基成分包括英國Oxoid公司GC瓊脂粉(批號：2202790)與無菌脫纖維羊血(購自廣州迪景公司)。頭孢曲松與頭孢克肟2種抗生素，以及世界衛生組織(WHO)標準菌株 (WHO G、WHO J、WHO K、WHO L、WHO P)均由中國疾病預防控制中心性病控制中心提供。采用WHO推薦的瓊脂稀釋法檢測菌株對頭孢曲松與頭孢克肟的藥敏值(MIC值)。結果判定標準為頭孢曲松MIC<0.125 mg/L為敏感，MIC≥0.125 mg/L為低敏；頭孢克肟為MIC<0.25 mg/L為敏感，MIC≥0.25 mg/L為低敏。臨床菌株與標準菌株復蘇后，經2次傳代，用18～20 h新鮮培養物配成0.5麥氏濃度菌懸液，菌懸液再經10倍稀釋后接種于含抗生素的瓊脂平板上，將平板置于35℃二氧化碳箱培養24～48 h觀察結果。每批試驗均加入已知MIC值的標準菌株進行全程質量控制。

1.2 DNA提取 淋球菌株復蘇經2 次傳代后，刮取平板上菌落于無菌生理鹽水中制成均勻的混懸液，并調整菌懸液濃度至0.5麥氏單位。Expure-20r全自動核酸提取儀及配套試劑(批號：20180603)由深圳匯研科創生物科技有限公司生產。實驗方法如下：向試劑盒六聯管第一孔加入180 μL菌懸液和20 μL核酸吸附劑，混勻后上機，儀器即可全自動完成核酸的純化和提取。

1.3 NG-MAST分型 用Martin等文獻報道方法[4]。實驗步驟如下：用PCR法擴增porB基因和tbpB基因，產物經凝膠電泳后，將正確位置條帶產物進行純化后測序(由南京勒伯生物技術有限公司完成)。porB基因測序結果與基因庫中已知序列(Gen Bank號:M21289)進行比對，選取por B基因擴增序列上一段490 bp大小片段進入NG-MAST網站比對以獲取其等位基因型別；tbpB基因測序結果與基因庫中已知序列(U65222)進行比對，選取tbpB基因擴增序列上一段390 bp大小片段進入NG-MAST網站比對以獲取tbpB基因等位基因型別；最后綜合porB和tbpB基因的等位基因型別從NG-MAST網站獲取該淋球菌株的基因型別。

2 結果

2.1 藥敏試驗結果及MIC值分布 共檢測193株臨床分離淋球菌，頭孢曲松的低敏率為5.2%，頭孢克肟的低敏率為13.5%。淋球菌株對2種抗生素的MIC值分布見表1。

表1 淋球菌株對2種抗生素的MIC值分布 株

2.2 NG-MAST型別分布 193株淋球菌共檢出125個型別，其中已知型別65(52%)種，新型別60(48%)種。菌株型別中以ST5308(n=7)、ST2268(n=7)、ST5061(n=7)、ST10091(n=4)、NEW1(n=6)、NEW2(n=4)和NEW3(n=4)為優勢型別，其中兩株菌同型別有21種，3株菌同型別有7種，其余為90種單一型別。

表3 優勢型別菌株對頭孢克肟的MIC值分布 株

2.3 NG-MAST優勢型別菌株對頭孢菌素的MIC值分布及耐藥情況 從表2、3中可見相同NG-MAST型別菌株對同一藥物敏感性具有相同或相近的MIC值，滴度相差不超過3個濃度級。7株ST5308型別菌株中有6株對頭孢克肟顯示低度敏感。另檢出成簇的ST 9659(n=3)型別菌株對頭孢曲松顯示低度敏感(MIC值均0.125 mg/L)。

表2 優勢型別菌株對頭孢曲松的MIC值分布 株

3 討論

本研究發現,中山地區淋球菌株對頭孢曲松與頭孢克肟的低敏率較高(5.2%和13.5%)，其中頭孢曲松的低敏率明顯高于近年國內山東(1.6%)、浙江(0.0%)的報道[5，6]，亦高于Chen等監測2012-2013年全國淋球菌株的報告水平(平均4.4%)[7]，但略低于2017年廣州地區的耐藥監測報道(6.9%)[8]；頭孢克肟的低敏率高于近年廣西壯族自治區的耐藥監測報道(11.3%)[9]，但與近年廣州地區的耐藥監測報道接近(15.8%)[8]。研究表明，中山地區淋球菌對第三代頭孢菌素有較高的低敏率，應重視淋球菌的耐藥性監測工作，以及加強臨床用藥的合理性和規范性使用管理。

Martin等[4]創建的NG-MAST基因分型法，是對兩個編碼淋球菌外膜蛋白基因(porB和tbpB)進行多態性測序分析，并與數據庫比對后獲得菌株的基因型別。該法具有操作簡便、結果客觀、實驗室間的可比性高等。有研究表明，ST型別相同菌株對同一抗生素的敏感性存在較穩定的一致性(MIC值集中于特定范圍)，由此可通過ST型別預測菌株對藥物的敏感性，并適合特定區域追蹤特殊菌株(如耐藥菌株)的傳播特征[9，10]。本研究發現:所檢菌株型別多達125種，其中已知型別與新型別種數分別為65(52%)和60(48%)種；印證同型別菌株對同一抗生素敏感性(MIC值)具相同或相近性的報道[10]；發現多個特殊菌株型別，即優勢型別ST5308(n=7)菌株對頭孢克肟呈低度敏感，與Yan等報道一致[11]；成簇的ST 9659(n=3)型別菌株對頭孢曲松低度敏感； ST 10091(n=4)優勢型別菌株恰為作者對本批菌株進行阿奇霉素耐藥性另一研究中的對阿奇霉素呈高度耐藥性的淋球菌(MIC值≥256 mg/L)[12]，對該型別的耐藥性于鄰近的深圳市曾有報道，但不屬于當地的優勢菌株型別[13]。上述情況表明，本地區淋球菌株NG-MAST 基因分型呈遺傳背景的多樣性，可通過檢測發現的特殊菌株型別，預測感染菌的耐藥性并指導臨床選用合理的治療方案，以及對提前干預特殊菌株的暴發流行有重要意義。

本市主要流行的ST5308、ST5061曾被Qin等報道為珠海市和廣州市流行的主要菌型，ST5061還是長沙市流行的主要菌型[14，15]。由于NG-MAST 基因分型法具較高分辨率，檢測技術標準化和結果具穩定性[16]，推測廣州、珠海、中山三市作為經濟發達地區，湖南則毗鄰廣東，是重要勞工輸出地，四地區間人員的流動性強，導致上述淋球菌型別的流行，ST5308、ST5061是上述四地共同流行的主要基因型別，提示可能存在一定的性傳播網絡關系。此外，近年本市與廣州地區的淋球菌對頭孢克肟的低敏率接近，可能與兩地共同出現對頭孢克肟低敏的優勢菌型ST5308有較大關系(占中山低敏菌率25%)。本地主要流行菌型ST10091在周邊或外省未見報道，提示該淋球菌型存在地域局限性流行情況，可能與該型別菌流入本市較早、傳播較廣并形成當地主要流行菌型有關。目前，為延緩淋球菌對頭孢菌素耐藥性進展，世界衛生組織推薦頭孢曲松聯合阿奇霉素作為治療淋病的策略，但本市淋球菌對阿奇霉素的耐藥性高[12]，并且出現對阿奇霉素呈高度耐藥性的ST10091優勢菌型，因此在中山地區不宜或慎用該策略。研究未發現在世界范圍內傳播較廣對頭孢菌素高度耐藥的ST1407淋球菌菌型，但其在國內的上海、廣西及我省廣州均有零星報道[7，14]，因此要高度關注該耐藥菌型和做好耐藥監測工作，以防流入本市。此外，本地區流行的主要菌型與Chen等報道我國最主要流行基因型不同，其報道為:所有地區流行ST2318；ST1866流行于南方(包括廣東，廣西和海南)和華東地區(包括浙江，江蘇和上海)；ST5062流行西南部；北部流行ST10290；而西北部流行ST4846[7]。說明不同地域所流行主要菌型可不相同。因此，為掌握中山地區淋球菌的分子流行病學狀況和落實淋病防控工作，運用NG-MAST基因分型技術進行監測并建立區域菌株型別數據庫十分必要。