小型香豬皮膚放創復合傷動物模型建立及維生素B12軟膏促愈作用機制研究

趙悅辰,孔維健,杜昊睿,楊小玉,王鐵君*,王嘉鵬,夏雪怡

(1.吉林大學第二醫院 放療科，吉林 長春130022;2.吉林大學第二醫院 骨科，吉林 長春130022;3.吉林省一汽總醫院 骨科，吉林 長春130011;4.吉林大學第二醫院眼科手術室，吉林 長春130022)

放射治療是目前臨床惡性腫瘤的主要治療方法之一，適用于大多數癌癥患者。放射治療結合外科手術已成為多種實體腫瘤的標準局部治療方法。在四肢軟組織肉瘤的治療中，采用放療聯合外科手術治療的方法，盡最大可能保留了功能性組織，避免了根治性切除和近端截肢，同時保持局部腫瘤控制率等于或優于單純根治性手術[1-3]。此外，這種聯合治療改善了乳腺癌、軟組織肉瘤、直腸癌、頭頸癌的術后功能和美容效果[4]。然而，術前放射治療的應用導致了皮膚放射損傷的發生，增加了術后傷口愈合并發癥的風險。據報道，在放療后的皮膚區域進行手術會導致半數以上的軟組織肉瘤患者出現并發癥，甚至出現遷延不愈的創傷[5-6]。這種合并放射損傷的皮膚創傷稱為“放創復合傷”。放射損傷與創傷合并后，常使放射損傷和創傷兩方面均有加重，其創面愈合特點更加遷延復雜，可能形成癢痛難忍、潰爛反復的難愈性創傷[7-9]。因此，開發一種能夠促進放射合并創傷的特效藥物，具有巨大的臨床效益與價值。

維生素B12是一種重要的生物活性物質，參與體內多種重要的生化反應。維生素B12可促進肉芽組織增生及上皮細胞再生，對受損皮膚黏膜上皮細胞及血管內皮細胞具有較強的修復再生功能[10-11]。傳統上維生素B12用于治療惡性貧血、神經炎和神經萎縮等疾病。近來研究發現，維生素B12對皮膚創傷、特別是放射損傷也具有一定改善作用。小型香豬是一種常見的實驗動物，因其皮膚形態和組織結構與人類皮膚高度相似，被廣泛用于構建皮膚模型研究。此外，小型香豬與家兔、豚鼠等動物相比對射線的耐受力更強，死亡率更低。因此，本研究中我們使用小型香豬建立了皮膚放創復合傷動物模型，通過對創面進行形態學和組織學分析，探究維生素B12軟膏對皮膚放創復合傷愈合的作用效果及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

小型香豬3只(n=3)，6-7月齡，體重15±2 kg，雌雄不限。飼養在吉林大學基礎醫學院動物實驗中心標準動物室(22℃)。

1.2 皮膚放創復合傷模型構建及形態學觀察

照射前對照射區域進行備皮，隨后靜脈注射3%戊巴比妥鈉進行麻醉，將麻醉后的香豬側臥位固定于照射臺上，使用VARIAN醫用直線加速器進行照射。每只香豬三個照射野，照射野大小 6×6 cm，野間距5 cm。照射劑量20Gy，照射劑量率4Gy/min，在受照野上覆蓋1 cm等效膜。照射后使用75%乙醇對受試部位皮膚進行消毒，在預先制備的塑料模型基礎上制備皮膚創面損傷。用刀片在每個照射野上等距切割3個深達皮下全層的圓形創面，直徑25 mm。將創面分為對照組、三乙醇胺組和維生素B12組，維生素B12組涂抹復方維生素B12軟膏Ⅱ號(主要成為維生素B12，硫酸慶大霉素)，1次/日；三乙醇胺組涂抹比亞芬燙傷膏(法國Biafine Act)，1次/日；對照組不給予藥物處理。

使用直徑25 mm圓形塑料片作為參照物，于0、5、9、13、21、25及29天對皮膚放創復合傷的損傷區域進行拍照記錄，用圖像分析軟件(Image-pro plus 6.0)測量創面面積。傷口愈合率根據以下公式確定：愈合率=[(A0-At)/A0]×100%，其中A0是時間為0時傷口的初始面積(t=0)，At是測量時的傷口面積。

1.3 組織學分析

模型構建后第29天對香豬進行安樂死，對各個皮膚放創傷損傷區域的組織進行取材。4%多聚甲醛固定24 h后進行包埋切片，厚度4 μm。使用相應的試劑盒對切片進行HE染色、Masson染色及天狼猩紅染色，倒置光學顯微鏡觀察組織變化。應用Image-Pro Plus6.0軟件對天狼猩紅染色切片分析，得出每張照片Ⅰ型和Ⅲ型膠原面積比。

1.4 統計學分析

所有定量數據均采用GraphPad Prism 5.0軟件進行分析，以均數±標準差表示。采用單因素方差分析(ANOVA)和t檢驗對兩個以上變量進行比較,P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 放創復合傷創口愈合情況

利用Image-pro plus 6.0軟件，我們對模型構建后不同時間節點皮膚創面的愈合情況進行了分析。在術后第一天時，各組均表現為明顯的皮膚放創損傷缺損，隨著時間的延長，各組的創面均開始不同程度的愈合。如圖1、2所示，在術后第9天前，三組創面之間的愈合情況并無顯著差異，從第13天開始，維生素B12組的放創傷創面開始明顯縮小，愈合率與對照組和三乙醇胺組相比顯著提升。三乙醇胺組與對照組相比較，在術后第21天前愈合速率和放創傷創面情況均無明顯差異，第25天時開始出現明顯區別，愈合速率較對照組相比出現明顯提升。至術后第29天時，維生素B12組愈合率為85.2%，三乙醇胺組愈合率為47.9%，對照組愈合很差，僅34.5%。與對照相比，維生素B12組、三乙醇胺組愈合率有統計學意義(P<0.05)。通過愈合率曲線發現，對照組一段時間內創面面積停留在相對恒定水平，即創傷愈合停滯期，成為經久不愈的“難愈性創傷”。維生素B12組與三乙醇胺組相比，愈合率較高(P<0.05)，證明維生素B12軟膏對放創復合傷的促愈作用優于對照藥物三乙醇胺。

圖1 不同時間點各組實驗動物皮膚放創復合傷外相

2.2 放創復合傷模型中各組的組織學的改變

皮膚的愈合過程中涉及多種細胞、組織和生長因子的相互作用，其中損傷后肉芽組織的形成、上皮化及皮膚附屬器官的再生是主要組成部分。利用HE染色我們對上述組織學變化進行了觀察，結果如圖3所示，可以看到對照組和三乙醇胺組創面區域可見大量結痂，新生組織結構較為疏松，而在維生素B12組中觀察到損傷中心區域無明顯結痂，組織結構更加致密，同時損傷區域再生組織與損傷兩側相比較并無明顯的分界線，這說明維生素B12組中形成的新生組織具有更高的融合度，能夠顯著促進皮膚放創復合傷后損傷區域的皮膚再生。此外我們還應用Image-pro plus 6.0軟件測量了各組相對表皮厚度、相對創口寬度。結果發現，與對照組相比，維生素B12組、三乙醇胺組相對表皮厚度顯著減小(P<0.01)；同時維生素B12組與對照組和三乙醇胺組相比，相對創口寬度顯著減小(P<0.01)。這些結果進一步證實了維生素B12軟膏對促進放創復合傷的愈合具有積極的促進作用。

圖2 各實驗組皮膚愈合曲線

圖3 皮膚放創傷損傷區域HE染色

放射損傷可造成皮膚大量膠原沉積形成，膠原和其他細胞外基質成分的過度堆積是導致放射性纖維化的重要原因。利用Masson染色，我們對損傷區域組織膠原纖維的含量進行了檢測。結果發現在放創復合傷模型中，Masson染色可見各組膠原沉積均增多(圖4)，維生素B12組膠原沉積量略少。因此，我們推測維生素B12對抑制放創復合傷中膠原瘢痕及纖維化形成有一定作用。

圖4 皮膚放創傷損傷區域Masson染色

2.3 放創復合傷模型中各組膠原表達量的改變

正常皮膚組織中，皮膚膠原成分主要以Ⅰ型膠原為主。皮膚創傷形成后，由于成纖維細胞大量增殖及分化延遲，導致膠原纖維大量沉積，此時主要以分泌Ⅲ型膠原為主。隨著組織修復程度提高，Ⅲ型膠原逐漸被Ⅰ型膠原所替代。因此，Ⅰ/Ⅲ型膠原比例可在一定程度上評價皮膚損傷的修復程度。利用天狼猩紅染色，我們觀察了各組不同處理后皮膚膠原含量的改變。在偏振光下，Ⅰ型膠原呈紅色或黃色，強雙折光性。Ⅲ型膠原呈綠色，弱雙折光性。應用Image-Pro Plus6.0軟件對每張照片進行分析，得出Ⅰ型和Ⅲ型膠原面積比。結果顯示，在放創復合傷模型中，各組中膠原總量相差不大。但在Ⅰ/Ⅲ型膠原比例的比較中，發現維生素B12組Ⅰ/Ⅲ型膠原比例顯著升高(P<0.01)，證明維生素B12組中成熟膠原較多，愈合效果良好。

圖5 各實驗組相對表皮厚度和創口相對寬度

圖6 皮膚放創復合傷損傷區域天狼星紅染色

圖7 各實驗組總膠原相對表達量和Ⅰ/Ⅲ型膠原比例

3 討論

放射治療聯合手術在多種腫瘤治療過程中顯示出巨大的優越性。首先，術前對腫瘤照射可以減少放射治療的總照射劑量[12]。其次，在手術切除腫瘤前進行放射治療，所受照射的正常組織體積要小得多[13]。以上因素均有助于減輕射線對腫瘤周圍正常組織造成的損傷，有助于改善患者的生存質量[14-15]。然而，術前實施的新輔助放療已被證實會引起手術傷口愈合的強度降低，造成傷口愈合緩慢甚至遷延不愈。皮膚組織受照射后會引起微血管損傷，導致血流量減少、缺血性損傷、纖維化、壞死、萎縮等。此外，膠原沉積缺陷、成纖維細胞輻射后發生功能異常，也是輻射后傷口愈合較差的重要原因[16]。

維生素B12是一種水溶性維生素。作為體內重要的生物活性物質，維生素B12以多種形式存在于體內，是同型半胱氨酸甲基轉移酶和甲基丙二酰輔酶A變位酶的輔酶，也是細胞合成核酸過程中的重要輔酶。維生素B12對于人體至關重要，尤其是血液和神經系統。外用維生素B12具有止癢、止痛及修復血管內皮細胞損傷的作用[17-18]。近來研究發現，維生素B12可改善放射線引起的皮膚、黏膜損傷，減輕放創反應，并顯示出了良好的效果[19-20]。

小型香豬是一種常見的實驗動物，因其皮膚形態和組織結構與人類皮膚高度相似，被廣泛用于構建皮膚模型研究。本研究中，我們使用小型香豬建立皮膚放創復合傷模型，設置對照組，三乙醇胺組，維生素B12組，隨后各自用藥處理。研究結果發現，維生素B12軟膏對放創復合傷的愈合和恢復具有明顯的促進效果。與對照組、三乙醇胺組相比，維生素B12組創口愈合率顯著升高，具有統計學意義(P<0.05)。HE染色結果表明，維生素B12組藥后減輕了放創復合傷的皮膚破壞程度。軟件測量顯示，與對照組相比，維生素B12組相對表皮厚度、相對創口寬度顯著減小(P<0.01)，與形態學結果一致，證實了維生素B12軟膏對放創復合傷愈合的積極作用。Masson染色表明，與對照組、三乙醇胺組相比，維生素B12組減少了皮膚膠原沉積量，可推測維生素B12對抑制放創復合傷中膠原瘢痕及纖維化形成有一定作用。天狼星紅染色結果表明，與Control組、三乙醇胺組相比，維生素B12組Ⅰ/Ⅲ型膠原比例顯著升高(P<0.01)，證明維生素B12組中成熟膠原較多，愈合效果良好。