T-SPOT.TB，TB-DNA及TB-RNA聯(lián)合檢測對菌陰肺結核的診斷價值

謝博文，盧春

（1.鄭州大學醫(yī)學院，河南 鄭州 450001；2.武漢市漢陽醫(yī)院，湖北 武漢 430050）

0 引言

目前，肺結核仍然是危害人類身體健康的常見慢性呼吸道傳染性疾病之一，結核分枝桿菌是其主要致病菌。盡管現(xiàn)在醫(yī)療水平迅速發(fā)展，而我國的肺結核發(fā)病率仍處世界前幾位。因此，控制其發(fā)病率關鍵要做到早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷及早期治療[1]。臨床上除了結合肺結核的臨床癥狀及體征外，還有常規(guī)影像學檢查手段包括胸部平片、CT等，而肺結核的確診主要依靠痰培養(yǎng)及涂片學檢查，但因結核桿菌生長周期長，痰培養(yǎng)耗時長及痰涂片檢出率低等缺點，使部分肺結核患者痰檢陰性，造成肺結核患者的漏診、誤診等。除了確診肺結核的痰培養(yǎng)及痰涂片等實驗室檢查外，最近在分子生物學及免疫學方面均有新的診療技術[2]。在所有肺結核類型中菌陰肺結核約占一半以上，故對其作出正確診斷及治療極為重要[3]。菌陰肺結核是指經(jīng)痰涂片分枝桿菌及痰培養(yǎng)檢測結果均為陰性的活動性肺結核，故常常容易忽略[4]。近年來，結核感染T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB），結核桿菌DNA（TB-DNA）及結核桿菌RNA（TB-RNA）試驗是作為診斷肺結核很好的實驗室檢查手段。T-SPOT.TB是在全血中通過定量檢測結核特異性抗原CFP-10及ESAT-6刺激下所釋放出的γ-INF的T淋巴細胞數(shù)目來用于診斷結核病[5-6]，TB-DNA則是以PCR技術用于病原體的核酸診斷，而TB-RNA的檢測主要以病原體RNA 為擴增靶標的核酸恒溫擴增檢測（SAT）技術。本文主要行T-SPOT.TB、TB-DNA、TB-RNA試驗聯(lián)合檢測與單用檢測進行對比分析，從而探討T-SPOT.TB、TB-DNA及TB-RNA聯(lián)合檢測對菌陰性肺結核的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料。選擇自2018年1月至2020年1月期間我院住院或門診期間經(jīng)痰涂片或痰培養(yǎng)確診為菌陰肺結核的191例患者，其中男115例，女76例，平均年齡（43.76±4.34）歲；同期選取113例非結核疾病患者作為對照組，其中男74例，女39例，平均年齡（40.45±3.15）歲；兩組患者間相關情況差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.1.1 初治菌陰肺結核組：即1次痰培養(yǎng)檢查及3次痰涂片檢查均為陰性的肺結核；所有191例菌陰性肺結核病例均符合2001年中華醫(yī)學會結核病分會制定的診斷標準[4]。

1.1.2 非結核疾病組：經(jīng)各項檢查明確排除結核類疾病的113例患者，其中上呼吸道感染67例、肺炎22例、支氣管擴張5例、慢性阻塞性肺疾病9例、肺癌1例，其他疾病9例。

1.2 檢測方法

1.2.1 SAT檢測TB-RNA：取痰液標本于離心機離心4 min，棄去上清；后置于2 mL 0.9%Nacl洗滌棄去上清液；加入60 uL TB液再次洗滌稀釋后，于300 W超聲波處理15 min后，再次離心10 min；取2 uL上述清液于30uL擴增管中；置于50℃恒溫儀器中保溫15 min；調至40℃中再次保溫5 min；然后每支反應管加10 uL SAT 酶液，混合均勻后將反應管快速轉至熒光定量PCR儀中；熒光檢測通道設定為FAM；40℃，50個循環(huán)，共1 min；熒光信號采集60 s一次，共40次；根據(jù)CT值判斷結果。SAT試劑盒由中山大學達安基因股份有限公司提供，儀器規(guī)格為ABI 7500 FAST型熒光定量PCR儀；

1.2.2 PCR檢測TB-DNA：取痰液標本于等體積4%NaOH，搖勻，常溫靜置30 min左右，取1 mL離心6 min后棄去上清液；加入DNA提取液；于100℃恒溫箱中維持15 min；取2 uL置于PCR試管中；置于熒光定量PCR儀進行擴增；按試劑說明書設定PCR 儀參數(shù)；根據(jù)CT值計算TB-DNA含量；TB-DNA 試劑為英國Oxford Immunotec公司提供的晶芯分枝桿菌核酸檢測試劑盒。熒光定量PCR儀由杭州博日科技有限公司的提供的檢測系統(tǒng)Bioer LineGene 9620。

1.2.3 T-SPOT.TB檢測方法：使用T-SPOT.TB方法（酶聯(lián)免疫斑點法）檢測，靜脈采集4mL外周血液并進行單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）分離；細胞洗滌干凈后將其濃度設置為250萬/mL；參照T-SPOT.TB試劑盒說明書并利用酶聯(lián)斑點計數(shù)儀計數(shù)每個專用微孔板內的斑點數(shù)量；陰性斑點數(shù)為0-5個。陽性標準為：①抗原A 和抗原B 檢測孔計數(shù)-陰性孔計數(shù)≥6；②陰性對照孔斑點數(shù)≥6，檢測孔斑點數(shù)≥2倍陰性孔斑點數(shù)。試劑盒由深圳達科為生物技術有限公司提供。

1.3 統(tǒng)計學分析。利用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析；符合正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，方差齊的計量資料，兩組間比較采用單獨樣本t檢驗，方差不齊的計量資料，兩組間比較采用t′檢驗；靈敏度及特異度等指標比較采用χ2檢驗；以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組一般資料比較。菌陰肺結核組、非結核疾病組兩組間年齡、性別構成體及質量構成差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組研究對象基線特征的比較

2.2 3種檢測方法的敏感度及特異度。T-SPOT.TB、TBRNA、TB-DNA試驗對初治菌陰肺結核的陽性率（敏感度）分別為94.8%，49.2%，63.4%；T-SPOT.TB、TBRNA、TB-DNA試驗對非結核疾病對照組的陰性率（特異度）分別為98.2%，95.6%，93.8%；可見T-SPOT.TB檢測方法對初治菌陰肺結核的敏感性及特異性均顯著；詳見表2。

表2 3項檢測方法的敏感性及特異性

2.3 三者聯(lián)合檢測對菌陰肺結核的陽性檢出率。含T-SPOT.TB的2聯(lián)對菌陰肺結核的陽性檢出率為93.7%；不含T-SPOT.TB的2聯(lián)對菌陰肺結核的陽性檢出率為84.1%；3聯(lián)檢測菌陰肺結核的陽性率為98.5%；可見含T-SPOT.TB的2聯(lián)陽性檢出率明顯高于不含T-SPOT.TB的2聯(lián)檢出率（P＜0.05）；3聯(lián)陽性檢出率明顯高于2聯(lián)檢出率（P＜0.01），詳見表3。

表3 聯(lián)合檢測對菌陰肺結核組的陽性檢出率

3 討論

雖然痰培養(yǎng)及涂片均能有效確診肺結核，目前臨床已廣泛運用，但其缺點是培養(yǎng)周期長，使多數(shù)患者不能立即確診，另外非活動性結核患者處于潛伏期感染以及陳舊性肺結核的存在，這給此部分患者帶來的誤診率極高[7]。然而，隨著醫(yī)療的發(fā)展，一些新型檢查技術不斷涌現(xiàn)，其中作為早期診斷肺結核疾病的實驗室檢查技術如T-SPOT.TB、TB-DNA、TB-RNA等已在某些醫(yī)院廣泛運用，但三者對菌陰肺結核診斷的敏感性及特異性方面報道各存差異。

PCR技術是目前臨床上較為流行的實驗室檢查手段，而TB-DNA作為結核分枝桿菌的遺傳物質，因此可通過PCR來檢測TB-DNA水平，故可以用于衡量感染的結核桿菌嚴重程度[8]。但由于受實驗室、試劑、標本等污染因素影響，且在PCR擴增過程中判定錯誤等均使結果易出現(xiàn)假陽性[9]。目前利用SAT 技術檢測TB-RNA已用于臨床檢測結核病[10]，通過以結核分枝桿菌RNA為擴增靶點，對產(chǎn)物RNA進行靶向檢測，故TB-RNA技術可以用于活動性肺結核的診斷及治療檢測，但其特異性及敏感性尚待于研究.。雖然TB-DNA、TB-RNA在檢測結核病中均顯優(yōu)勢，但其特異性及敏感性均不及T-SPOT.TB顯著，而本研究結果亦證實T-SPOT.TB在檢測菌陰肺結核方面優(yōu)于以上兩種檢測手段，結果亦表明含有T-SPOT.TB的二聯(lián)檢測手段對菌陰肺結核的檢出率明顯高于不含T-SPOT.TB的檢出率。

T-SPOT.TB技術是2001年由Dogra[11]等提出，提取經(jīng)結核分枝桿菌感染的患者外周血單個核細胞中特異性活化的T細胞，后者在受到結核桿菌特異性抗原刺激后分泌干擾素-γ而設計的T細胞試驗，從而通過斑點數(shù)來推測體內是否存在對結核桿菌反應的T細胞用于結核桿菌感染進行輔助診斷[12]。本研究表明，T-SPOT.TB在菌陰肺結核檢測的敏感性為94.8%，特異性為98.2%，顯著優(yōu)于TB-DNA和TB-RNA兩種檢測方法，此與浦永蘭等[13]表明T-SPOT.TB在菌陰肺結核組中的敏感性及特異性分別為89.6%和91.1%相接近。本研究顯示，結合TB-DNA、TB-RNA，三者聯(lián)合檢測菌陰肺結核的陽性率為98.5%；可見含T-SPOT.TB的2聯(lián)陽性檢出率明顯高于不含T-SPOT.TB的2聯(lián)檢出率（P＜0.05）；3聯(lián)陽性檢出率明顯高于2聯(lián)檢出率（P＜0.01）；另外，T-SPOT.TB檢測不受是否排菌、排菌數(shù)量以及排菌類型的影響，故在臨床檢測中較為準確及快速，對菌陰肺結核的診斷意義重大，可以作為結核病早期快速診斷的有效手段。但其缺點在于無法區(qū)分死活菌及非結核分枝桿菌類型，這無疑降低其特異性[14]。

綜上可知，T-SPOT.TB、TB-DNA及TB-RNA三種方法聯(lián)合檢測對菌陰肺結核的陽性檢出率顯著高于單獨檢測率。因此，在今后臨床中推薦三聯(lián)檢測菌陰肺結核方案極大提高其檢出率，使漏診率大大降低，值得臨床推廣。