兒童EBV感染相關疾病在不同標本類型中EBV-DNA檢測的比較

付瑞，吳江堯，夏菜榮，孫麗，鄭雯娜

（曲靖市婦幼保健院 云南 曲靖 655000）

0 引言

EB病毒是皰疹病毒科嗜淋巴細胞病毒屬的成員，具有在體內外專一性地感染人類及某些靈長類B細胞的生物學特性，有較高的感染率[1]。據統計，人群中EB病毒的感染率高達90%以上[2]，且兒童占絕大比例。兒童期EB病毒感染以原發感染常見，臨床表現多樣，累及多系統多器官，病情輕重不一，給臨床診斷和治療造成困難，因此實驗室診斷顯得尤為重要。近年來，熒光定量PCR檢測技術發展迅速，很多醫院都將其應用于EBV DNA的檢測，但對其檢測樣本選取仍然存在不同的意見[3]。本研究采用熒光定量PCR法探討在兒童EB病毒感染相關疾病中外周血白細胞和血漿中EBV DNA表達的差異，為臨床檢測樣本的選擇提供依據。

1 資料與方法

1.1 研究對象。收集2018年5月至2019年5月到我院就診的120列疑似EB病毒感染患兒的全血樣本，包括呼吸道感染54例、傳染性單核細胞增多癥31例、淋巴結炎22例、過敏性紫癜13例。

1.2 樣本采集。采集患兒的外周靜脈血約1 mL，注入EDTA抗凝采血管中。

1.3 儀器與試劑。EB病毒核酸定量檢測試劑盒、紅細胞裂解液、濃縮液及核酸釋放劑均購自圣湘生物科技股份有限公司，聚合酶鏈反應（PCR）擴增儀（SLAN 96P）購自上海宏石醫療科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 外周血白細胞EBV DNA提取：向1 mL紅細胞裂解液中加入800μl外周血，12000 rpm離心1分鐘，棄上清，再加入1 mL紅細胞裂解液，12000 rpm離心3分鐘，棄上清，加入1 mL生理鹽水，12000 rpm離心10分鐘，棄上清，加入400μl核酸釋放劑，75C°恒溫處理10分鐘。

1.4.2 血漿EBV DNA提取：向1.5 mL 離心管中加入100μl濃縮液，加入100μl血漿，13000 rpm離心5分鐘。棄上清，加入50 μl核酸釋放劑，靜置10分鐘。

1.5 PCR擴增。循環參數為：UNG 酶反應50℃ 2 min；Taq 酶活化94℃ 5 min；變性94℃ 15 s，退火、延伸、及熒光采集57℃ 30 s。目的基因CT值≤39，且內標CT值≤40的樣本，檢測結果為陽性。

1.6 統計學處理。計數資料以百分率表示，組間比較實施配對卡方檢驗。以α=0.05為檢驗水準，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 外周血白細胞和血漿中EBV DNA檢出率比較。外周血白細胞和血漿中EBV DNA的檢出率分別為77.5%（93/120）、37.5%（45/120），差異具有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 外周血白細胞和血漿中EBV DNA檢出率比較（n，%）

2.2 兩種標本類型在兒童EB病毒感染相關疾病中的檢出率比較。呼吸道感染、傳染性單核細胞增多癥、淋巴結炎、過敏性紫癜患者外周血白細胞及血漿EBV DNA的檢出率分別為43%、29%、14%、7%和25%、12%、6%、2%見表2。

表2 兩種標本類型在兒童EB病毒感染相關疾病中的檢出率比較

3 討論

1964年Epstein、Barr和Achong在Burkitt淋巴瘤細胞系觀察到病毒顆粒，稱為Epstein-Barr病毒（EBV），屬γ-皰疹病毒亞科淋巴淺隱病毒屬，是雙鏈DNA病毒[4]。EBV病毒感染具有較高的感染率，且機體因個體差異性其感染后呈現出的臨床癥狀表現具有差異性，癥狀多元化，是一種亞急性或者急性的全身性疾病之一，其對于嬰幼兒和兒童的危害性相對更強。此類患者在感染病毒后其血清學的反應情況極為復雜，呈現出多樣化的變化趨勢，而血清學經驗也做臨床中用以診斷EBV感染的主要參考依據，但其中部分患兒的抗EBVCA-IgM仍然存在延遲和常時間存在的情況，較之機體免疫力下降，使得其感染早期的抗體未形成，因此導致在進行血清檢驗時出現的誤診和漏診的情況，因此具有一定的局限性。而熒光定量PCR是在醫療技術不斷發展下形成的新型檢測技術，其具有操作便捷、特異性強且靈敏度高的特點，因此被廣泛應用于臨床檢測中，其對于疾病的診斷準確率得到醫務人員的一致肯定和支持。

大多數EBV感染發生在兒童時期，相關文獻報道，我國3～5歲兒童EB病毒抗體陽性檢出率高達80.7%[5]。陸萍等[6]對8209例住院兒童EBV感染情況進行分析，研究表明8209例兒科住院病人EBV感染率為68.84%。杜昆等[7]對5768例學齡前兒童EBV感染情況進行分析，結果顯示學齡前兒童EBV新發感染率為15.6%，累計感染率為48.1%。本研究采用熒光定量PCR法對EB病毒感染患兒的外周血白細胞和血漿中的EBV DNA進行檢測，結果顯示外周血白細胞和血漿中EBV DNA的檢出率分別為77.5%（93/120）、37.5%（45/120），差異具有統計學意義。牟文鳳等[8]對245例疑似EB病毒感染的住院患兒采用實時熒光定量PCR法檢測全血和血漿中EBV-DNA載量，結果顯示血漿EBV DNA陽性率和拷貝數均明顯低于全血。喻晶等[9]研究了淋巴細胞及血漿EB病毒DNA在EBV感染相關疾病中的表達，結果顯示ll2例患者外周血淋巴細胞和血漿中的EBV DNA，其總的陽性率分別為83.0%（93／112），27.7%（31／112）。

綜上所述，在兒童EB病毒感染相關疾病中，外周血白細胞EBV DNA的檢出率較血漿EBV DNA的檢出率高，其具有極高的臨床應用價值，對于小兒EBV感染等相關疾病的早期診斷和病情發展情況判定具有重要的現實意義，但本研究納入的相關病種較少，且樣本量較少使得結果具有一定的局限性，還需加大樣本量及增加病種進一步研究[10-12]。