兒童EBV感染相關(guān)疾病在不同標(biāo)本類型中EBV-DNA檢測的比較

付瑞，吳江堯，夏菜榮，孫麗，鄭雯娜

（曲靖市婦幼保健院 云南 曲靖 655000）

0 引言

EB病毒是皰疹病毒科嗜淋巴細(xì)胞病毒屬的成員，具有在體內(nèi)外專一性地感染人類及某些靈長類B細(xì)胞的生物學(xué)特性，有較高的感染率[1]。據(jù)統(tǒng)計，人群中EB病毒的感染率高達(dá)90%以上[2]，且兒童占絕大比例。兒童期EB病毒感染以原發(fā)感染常見，臨床表現(xiàn)多樣，累及多系統(tǒng)多器官，病情輕重不一，給臨床診斷和治療造成困難，因此實(shí)驗(yàn)室診斷顯得尤為重要。近年來，熒光定量PCR檢測技術(shù)發(fā)展迅速，很多醫(yī)院都將其應(yīng)用于EBV DNA的檢測，但對其檢測樣本選取仍然存在不同的意見[3]。本研究采用熒光定量PCR法探討在兒童EB病毒感染相關(guān)疾病中外周血白細(xì)胞和血漿中EBV DNA表達(dá)的差異，為臨床檢測樣本的選擇提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象。收集2018年5月至2019年5月到我院就診的120列疑似EB病毒感染患兒的全血樣本，包括呼吸道感染54例、傳染性單核細(xì)胞增多癥31例、淋巴結(jié)炎22例、過敏性紫癜13例。

1.2 樣本采集。采集患兒的外周靜脈血約1 mL，注入EDTA抗凝采血管中。

1.3 儀器與試劑。EB病毒核酸定量檢測試劑盒、紅細(xì)胞裂解液、濃縮液及核酸釋放劑均購自圣湘生物科技股份有限公司，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增儀（SLAN 96P）購自上海宏石醫(yī)療科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 外周血白細(xì)胞EBV DNA提取：向1 mL紅細(xì)胞裂解液中加入800μl外周血，12000 rpm離心1分鐘，棄上清，再加入1 mL紅細(xì)胞裂解液，12000 rpm離心3分鐘，棄上清，加入1 mL生理鹽水，12000 rpm離心10分鐘，棄上清，加入400μl核酸釋放劑，75C°恒溫處理10分鐘。

1.4.2 血漿EBV DNA提?。合?.5 mL 離心管中加入100μl濃縮液，加入100μl血漿，13000 rpm離心5分鐘。棄上清，加入50 μl核酸釋放劑，靜置10分鐘。

1.5 PCR擴(kuò)增。循環(huán)參數(shù)為：UNG 酶反應(yīng)50℃ 2 min；Taq 酶活化94℃ 5 min；變性94℃ 15 s，退火、延伸、及熒光采集57℃ 30 s。目的基因CT值≤39，且內(nèi)標(biāo)CT值≤40的樣本，檢測結(jié)果為陽性。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理。計數(shù)資料以百分率表示，組間比較實(shí)施配對卡方檢驗(yàn)。以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血白細(xì)胞和血漿中EBV DNA檢出率比較。外周血白細(xì)胞和血漿中EBV DNA的檢出率分別為77.5%（93/120）、37.5%（45/120），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 外周血白細(xì)胞和血漿中EBV DNA檢出率比較（n，%）

2.2 兩種標(biāo)本類型在兒童EB病毒感染相關(guān)疾病中的檢出率比較。呼吸道感染、傳染性單核細(xì)胞增多癥、淋巴結(jié)炎、過敏性紫癜患者外周血白細(xì)胞及血漿EBV DNA的檢出率分別為43%、29%、14%、7%和25%、12%、6%、2%見表2。

表2 兩種標(biāo)本類型在兒童EB病毒感染相關(guān)疾病中的檢出率比較

3 討論

1964年Epstein、Barr和Achong在Burkitt淋巴瘤細(xì)胞系觀察到病毒顆粒，稱為Epstein-Barr病毒（EBV），屬γ-皰疹病毒亞科淋巴淺隱病毒屬，是雙鏈DNA病毒[4]。EBV病毒感染具有較高的感染率，且機(jī)體因個體差異性其感染后呈現(xiàn)出的臨床癥狀表現(xiàn)具有差異性，癥狀多元化，是一種亞急性或者急性的全身性疾病之一，其對于嬰幼兒和兒童的危害性相對更強(qiáng)。此類患者在感染病毒后其血清學(xué)的反應(yīng)情況極為復(fù)雜，呈現(xiàn)出多樣化的變化趨勢，而血清學(xué)經(jīng)驗(yàn)也做臨床中用以診斷EBV感染的主要參考依據(jù)，但其中部分患兒的抗EBVCA-IgM仍然存在延遲和常時間存在的情況，較之機(jī)體免疫力下降，使得其感染早期的抗體未形成，因此導(dǎo)致在進(jìn)行血清檢驗(yàn)時出現(xiàn)的誤診和漏診的情況，因此具有一定的局限性。而熒光定量PCR是在醫(yī)療技術(shù)不斷發(fā)展下形成的新型檢測技術(shù)，其具有操作便捷、特異性強(qiáng)且靈敏度高的特點(diǎn)，因此被廣泛應(yīng)用于臨床檢測中，其對于疾病的診斷準(zhǔn)確率得到醫(yī)務(wù)人員的一致肯定和支持。

大多數(shù)EBV感染發(fā)生在兒童時期，相關(guān)文獻(xiàn)報道，我國3～5歲兒童EB病毒抗體陽性檢出率高達(dá)80.7%[5]。陸萍等[6]對8209例住院兒童EBV感染情況進(jìn)行分析，研究表明8209例兒科住院病人EBV感染率為68.84%。杜昆等[7]對5768例學(xué)齡前兒童EBV感染情況進(jìn)行分析，結(jié)果顯示學(xué)齡前兒童EBV新發(fā)感染率為15.6%，累計感染率為48.1%。本研究采用熒光定量PCR法對EB病毒感染患兒的外周血白細(xì)胞和血漿中的EBV DNA進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示外周血白細(xì)胞和血漿中EBV DNA的檢出率分別為77.5%（93/120）、37.5%（45/120），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。牟文鳳等[8]對245例疑似EB病毒感染的住院患兒采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測全血和血漿中EBV-DNA載量，結(jié)果顯示血漿EBV DNA陽性率和拷貝數(shù)均明顯低于全血。喻晶等[9]研究了淋巴細(xì)胞及血漿EB病毒DNA在EBV感染相關(guān)疾病中的表達(dá)，結(jié)果顯示ll2例患者外周血淋巴細(xì)胞和血漿中的EBV DNA，其總的陽性率分別為83.0%（93／112），27.7%（31／112）。

綜上所述，在兒童EB病毒感染相關(guān)疾病中，外周血白細(xì)胞EBV DNA的檢出率較血漿EBV DNA的檢出率高，其具有極高的臨床應(yīng)用價值，對于小兒EBV感染等相關(guān)疾病的早期診斷和病情發(fā)展情況判定具有重要的現(xiàn)實(shí)意義，但本研究納入的相關(guān)病種較少，且樣本量較少使得結(jié)果具有一定的局限性，還需加大樣本量及增加病種進(jìn)一步研究[10-12]。