端粒酶在人子宮頸病變早期診斷中的應用價值研究

許榮芬

（安寧市人民醫院 病理科，云南 昆明 650300）

0 引言

宮頸癌是臨床常見惡性腫瘤之一，該疾病發生率僅低于乳腺癌，在惡性腫瘤中占據第二位，同時也是造成女性群體發生死亡的一種惡性腫瘤。近年來，據相關研究顯示，在我國宮頸癌疾病的發生率呈逐漸上升狀態，且發病年齡越來越年輕化[1]。本研究以我院138例CIN、23例宮頸癌患者及20例正常宮頸患者為例，探討應用端粒酶的診斷價值，并總結hTERT的表達特點，現詳細匯總如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料。病例選取經臨床病理結果證實的Ca、CIN患者138例、23例，所有患者均經過病理檢查確診，另選取同期宮頸活檢病理正常的20名作為對照組。患者年齡26～59歲，平均（38.6±5.1）歲。另選取同期因子宮肌瘤、子宮腺肌癥行子宮切除、經術后病理結果證實屬于正常宮頸的 20例患者作為對照組，患者年齡分布為25～59歲，平均（37.5±4.1）歲。在138例確診CIN患者中，I級有68例、Ⅱ級有42例，Ⅲ級有28例。其中不典型增生病例診斷標準參照Richard CIN分級；選取各實驗組典型病例進行下一步免疫組化檢查。

1.2 試劑和方法。免疫組織化學SP法檢測單克隆性端粒酶：以濃度為4%的甲醛對所有組織進行固定，并常規以石蠟展開包理處理，所有操作均嚴格根據試劑盒相關說明書來操作，主要方法如下：①將組織塊切片，厚度在4-6μm左右，經60℃烤片1h 以上；②脫蠟、水化：然后按照順序，分別將二甲苯與酒精放置在載玻片上；③抗原修復：高壓鍋內加熱入2000 mL檸檬酸緩沖液中煮沸后，放入切片繼續煮沸2 min，然后自然冷卻超10 min后，在借助冷水對高壓鍋進行沖洗，加快其冷卻濕度，當冷卻至室溫后，以PBS進行2～3次沖洗，每次沖洗時間為3 min左右；④封閉：將濃度為3%的H2O2封閉液加入，在室溫狀態下進行孵育，時間為10 min，并用PBS進行沖洗，沖洗次數為2次至3次，每次的沖洗時間應在3 min左右；⑤滴加一抗，端粒酶單克隆抗體50μL，于室溫狀態下進行1 h的孵育，以PBS沖洗2次至3次，每一次的沖洗時間應在5 min左右；⑥加入50μL含有二抗的辣根過氧化物酶標記物，于室溫下放置20 min后，以PBS進行沖洗2次至3次，每次的沖洗時間應當在5 min；⑦顯色：將DAB顯色液加入后，于靜置狀態下放置5～10 min后，借助自來水進行5 min的沖洗，以此來終止反應；⑧復染：以蘇木精進行1 min的復染，并以鹽酸、酒精來分化，利用自來水進行沖洗后，常規脫水，透明，封片，鏡檢。

1.3 免疫組化結果判定標準。以細胞核棕黃色顆粒為陽性。染色強度的分極標準：陰性結果：0%～10%為細胞顯色；+：l0%～25 %細胞顯色；++：26%～50%細胞顯色；+++：5l%～75%細胞顯色；++++：＞76% 細胞顯色。

1.4 統計學分析。統計學處理：數據處理采用統計軟件SPSS10.0，用χ2檢驗、單向方差分析（One-way ANOVA）和雙變量相關分析（Bivariate）進行統計學處理，P＜0.05 為統計學顯著水平。

2 結果

由表1可知，經分析各組中hTERT 蛋白的表達情況，Ca陽性率最高，達95.65%，其次為CIN III級75.00%、CIN II級61.90%、CIN I級14.70%與對照組5.00%；相較于對照組與CIN I級患者，Ca患者與CINⅡ級及Ⅲ級患者的陽性率較高，χ2=4.8398、8.7636（P＜0.05）；CIN I陽性率略高于對照組，χ2=1.3311（P＞0.05），無顯著性差異。

表1 分析三組標本中hTERT蛋白表達結果

3 討論

3.1 端粒、端粒酶，在真核細胞的染色體末端處，端粒屬于特有的一種結構，主要是由端粒及串聯重復短DNA序列與蛋白相結合，所形成的一種復合體。在人類的染色體中，端粒DNA蓄屬于5’TTAGG 3’中的一種短片段，是由大約155～250個的重復單位所組成。在進化方面，這些序號十分保守，可使得染色體的末端具備情形特點。在結構功能上，端粒主要有兩方面表現，一種是能夠對染色體基因組進行有效保護，避免其受到端粒酶對其的降解；還有一種則是端粒能夠重復向染色體末端供給可消耗的一種非編碼序列，進而取消或者暫時緩沖因末端復制穩定而發生染色體DBA縮短情況。對于大部分普通的體細胞來講，每次都會跟隨細胞進行分裂，而端粒則會逐漸變短，每次都會丟失一部分核苷酸，大約在50～200個左右，它能夠對細胞增殖能力進行縮短與限制，因此它的長度被當作對細胞分裂次數進行計算的有絲分裂鐘或者是生物鐘。

端粒酶屬于核糖核蛋白的一種復合體，主要是由蛋白質與RNA所組成，可逆轉錄酶活性，通過將自身RNA作為模板，合成TTAGG（端粒DNA重復序列），進而對端粒長度進行穩定。不僅在少數的造血干細胞、生殖細胞與胚胎組織內含有端粒酶的活性以外，很大一部分的體細胞中并未含有端粒酶活性。通常情況下，在正常的細胞周期當中，細胞每進行1次分裂，染色體就會丟失掉一些含端粒序列核苷酸，大約50～200個；當細胞在經多次的分裂之后，端粒就會逐漸開始縮短，直至達到臨界長度后，就無法對染色體進行保護，染色體就有可能出現重組或者降解情況，細胞就會停止分裂，直至衰老、死亡。然而較為異常的是，在大部分惡性腫瘤的細胞當中，對于已縮短端粒則借助某一種方式端粒酶活性激活，將其合成端粒這項功能充分發揮出來，以此來補償正常端粒丟失、縮短現象，促使端粒無法到達臨界的長度。這樣做可使得此細胞無法進入正常老化及衰亡過程，進而取得一種“永生”的能力。這樣，一個惡性增殖的腫瘤細胞克隆便宣告形成。

3.2 端粒酶作為腫瘤標記物早期診斷腫瘤。通過測定和研究表明，大多數腫瘤組織細胞有較高的端粒酶表達，而且在原位癌、發育異常等端粒酶表達的頻率很高[3]。表明端粒酶是腫瘤多步驟形成過程中的早期事件。

3.3 宮頸癌中端粒酶的研究概況。Frost等應用免疫組化（immunohistochemistry，IHC）、原位雜交（in situ hybridization，ISH）的方法研究對子宮頸癌、異型增生中hTERT/hTR表達定位研究表明癌組織、異型增生組織和正常黏膜相比，二者的表達不同，陽性細胞在癌/異型組織中增多，正常組織僅局限于基底層。但國內，張波等用其研制HTERT單克隆抗體對宮頸癌組織進行測試，陽性率僅為61.9%（13/21）[4]。人染色體端粒酶RNA（human telomerase RNA component，hTERC）位于3號染色體長臂，端粒酶本質是核蛋白逆轉錄酶，作用是修補 DNA 復制過程中損傷的端粒，可以保證端粒在細胞分裂時減少損耗，使細胞能夠持續分裂。當端粒酶活性被激活，正常細胞得以不斷分裂，即惡性增殖，賦予細胞永生性，形成腫瘤細胞，宮頸癌就此發生。

目前，宮頸癌及其癌前病變的早期診斷主要依據HE切片光鏡下診斷，診斷具有一定的主觀性，有時與反應性、修復性改變難以鑒別，導致早期診斷困難。運用免疫組化方法檢測端粒酶活性，該技術方法成熟，操作簡單，經濟可行，可用于臨床病理診斷，為宮頸癌的早期診斷提供客觀指標[5]。目前已證實宮頸低級別上皮內病變與高級別上皮內病變是感染不同型別HPV的結果，低級別上皮內病變是感染低危型HPV，而高級別上皮內病變是感染高危型HPV的結果。低級別上皮內病變相當于CINI，而高級別上皮內病變相當于CINII和CINIII，實際工作中經常會碰到難于鑒別低級別和高級別上皮內病變的情況。因臨床對低級別和高級別上皮內病變的處理是不同的，病理診斷準確區分這兩者病變就顯得尤為重要。我們的實驗中CINI級的病變端粒酶陽性表達率僅為14.7%，是否可以應用端粒酶免疫表達來協助鑒別診斷一些不典型的低級別與高級別上皮內病變，有待進一步研究。