端粒酶在人子宮頸病變早期診斷中的應(yīng)用價(jià)值研究

許榮芬

（安寧市人民醫(yī)院 病理科，云南 昆明 650300）

0 引言

宮頸癌是臨床常見惡性腫瘤之一，該疾病發(fā)生率僅低于乳腺癌，在惡性腫瘤中占據(jù)第二位，同時(shí)也是造成女性群體發(fā)生死亡的一種惡性腫瘤。近年來，據(jù)相關(guān)研究顯示，在我國宮頸癌疾病的發(fā)生率呈逐漸上升狀態(tài)，且發(fā)病年齡越來越年輕化[1]。本研究以我院138例CIN、23例宮頸癌患者及20例正常宮頸患者為例，探討應(yīng)用端粒酶的診斷價(jià)值，并總結(jié)hTERT的表達(dá)特點(diǎn)，現(xiàn)詳細(xì)匯總?cè)缦隆?/p>

1 資料與方法

1.1 一般資料。病例選取經(jīng)臨床病理結(jié)果證實(shí)的Ca、CIN患者138例、23例，所有患者均經(jīng)過病理檢查確診，另選取同期宮頸活檢病理正常的20名作為對照組。患者年齡26～59歲，平均（38.6±5.1）歲。另選取同期因子宮肌瘤、子宮腺肌癥行子宮切除、經(jīng)術(shù)后病理結(jié)果證實(shí)屬于正常宮頸的 20例患者作為對照組，患者年齡分布為25～59歲，平均（37.5±4.1）歲。在138例確診CIN患者中，I級(jí)有68例、Ⅱ級(jí)有42例，Ⅲ級(jí)有28例。其中不典型增生病例診斷標(biāo)準(zhǔn)參照Richard CIN分級(jí)；選取各實(shí)驗(yàn)組典型病例進(jìn)行下一步免疫組化檢查。

1.2 試劑和方法。免疫組織化學(xué)SP法檢測單克隆性端粒酶：以濃度為4%的甲醛對所有組織進(jìn)行固定，并常規(guī)以石蠟展開包理處理，所有操作均嚴(yán)格根據(jù)試劑盒相關(guān)說明書來操作，主要方法如下：①將組織塊切片，厚度在4-6μm左右，經(jīng)60℃烤片1h 以上；②脫蠟、水化：然后按照順序，分別將二甲苯與酒精放置在載玻片上；③抗原修復(fù)：高壓鍋內(nèi)加熱入2000 mL檸檬酸緩沖液中煮沸后，放入切片繼續(xù)煮沸2 min，然后自然冷卻超10 min后，在借助冷水對高壓鍋進(jìn)行沖洗，加快其冷卻濕度，當(dāng)冷卻至室溫后，以PBS進(jìn)行2～3次沖洗，每次沖洗時(shí)間為3 min左右；④封閉：將濃度為3%的H2O2封閉液加入，在室溫狀態(tài)下進(jìn)行孵育，時(shí)間為10 min，并用PBS進(jìn)行沖洗，沖洗次數(shù)為2次至3次，每次的沖洗時(shí)間應(yīng)在3 min左右；⑤滴加一抗，端粒酶單克隆抗體50μL，于室溫狀態(tài)下進(jìn)行1 h的孵育，以PBS沖洗2次至3次，每一次的沖洗時(shí)間應(yīng)在5 min左右；⑥加入50μL含有二抗的辣根過氧化物酶標(biāo)記物，于室溫下放置20 min后，以PBS進(jìn)行沖洗2次至3次，每次的沖洗時(shí)間應(yīng)當(dāng)在5 min；⑦顯色：將DAB顯色液加入后，于靜置狀態(tài)下放置5～10 min后，借助自來水進(jìn)行5 min的沖洗，以此來終止反應(yīng)；⑧復(fù)染：以蘇木精進(jìn)行1 min的復(fù)染，并以鹽酸、酒精來分化，利用自來水進(jìn)行沖洗后，常規(guī)脫水，透明，封片，鏡檢。

1.3 免疫組化結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)。以細(xì)胞核棕黃色顆粒為陽性。染色強(qiáng)度的分極標(biāo)準(zhǔn)：陰性結(jié)果：0%～10%為細(xì)胞顯色；+：l0%～25 %細(xì)胞顯色；++：26%～50%細(xì)胞顯色；+++：5l%～75%細(xì)胞顯色；++++：＞76% 細(xì)胞顯色。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：數(shù)據(jù)處理采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS10.0，用χ2檢驗(yàn)、單向方差分析（One-way ANOVA）和雙變量相關(guān)分析（Bivariate）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，P＜0.05 為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著水平。

2 結(jié)果

由表1可知，經(jīng)分析各組中hTERT 蛋白的表達(dá)情況，Ca陽性率最高，達(dá)95.65%，其次為CIN III級(jí)75.00%、CIN II級(jí)61.90%、CIN I級(jí)14.70%與對照組5.00%；相較于對照組與CIN I級(jí)患者，Ca患者與CINⅡ級(jí)及Ⅲ級(jí)患者的陽性率較高，χ2=4.8398、8.7636（P＜0.05）；CIN I陽性率略高于對照組，χ2=1.3311（P＞0.05），無顯著性差異。

表1 分析三組標(biāo)本中hTERT蛋白表達(dá)結(jié)果

3 討論

3.1 端粒、端粒酶，在真核細(xì)胞的染色體末端處，端粒屬于特有的一種結(jié)構(gòu)，主要是由端粒及串聯(lián)重復(fù)短DNA序列與蛋白相結(jié)合，所形成的一種復(fù)合體。在人類的染色體中，端粒DNA蓄屬于5’TTAGG 3’中的一種短片段，是由大約155～250個(gè)的重復(fù)單位所組成。在進(jìn)化方面，這些序號(hào)十分保守，可使得染色體的末端具備情形特點(diǎn)。在結(jié)構(gòu)功能上，端粒主要有兩方面表現(xiàn)，一種是能夠?qū)θ旧w基因組進(jìn)行有效保護(hù)，避免其受到端粒酶對其的降解；還有一種則是端粒能夠重復(fù)向染色體末端供給可消耗的一種非編碼序列，進(jìn)而取消或者暫時(shí)緩沖因末端復(fù)制穩(wěn)定而發(fā)生染色體DBA縮短情況。對于大部分普通的體細(xì)胞來講，每次都會(huì)跟隨細(xì)胞進(jìn)行分裂，而端粒則會(huì)逐漸變短，每次都會(huì)丟失一部分核苷酸，大約在50～200個(gè)左右，它能夠?qū)?xì)胞增殖能力進(jìn)行縮短與限制，因此它的長度被當(dāng)作對細(xì)胞分裂次數(shù)進(jìn)行計(jì)算的有絲分裂鐘或者是生物鐘。

端粒酶屬于核糖核蛋白的一種復(fù)合體，主要是由蛋白質(zhì)與RNA所組成，可逆轉(zhuǎn)錄酶活性，通過將自身RNA作為模板，合成TTAGG（端粒DNA重復(fù)序列），進(jìn)而對端粒長度進(jìn)行穩(wěn)定。不僅在少數(shù)的造血干細(xì)胞、生殖細(xì)胞與胚胎組織內(nèi)含有端粒酶的活性以外，很大一部分的體細(xì)胞中并未含有端粒酶活性。通常情況下，在正常的細(xì)胞周期當(dāng)中，細(xì)胞每進(jìn)行1次分裂，染色體就會(huì)丟失掉一些含端粒序列核苷酸，大約50～200個(gè)；當(dāng)細(xì)胞在經(jīng)多次的分裂之后，端粒就會(huì)逐漸開始縮短，直至達(dá)到臨界長度后，就無法對染色體進(jìn)行保護(hù)，染色體就有可能出現(xiàn)重組或者降解情況，細(xì)胞就會(huì)停止分裂，直至衰老、死亡。然而較為異常的是，在大部分惡性腫瘤的細(xì)胞當(dāng)中，對于已縮短端粒則借助某一種方式端粒酶活性激活，將其合成端粒這項(xiàng)功能充分發(fā)揮出來，以此來補(bǔ)償正常端粒丟失、縮短現(xiàn)象，促使端粒無法到達(dá)臨界的長度。這樣做可使得此細(xì)胞無法進(jìn)入正常老化及衰亡過程，進(jìn)而取得一種“永生”的能力。這樣，一個(gè)惡性增殖的腫瘤細(xì)胞克隆便宣告形成。

3.2 端粒酶作為腫瘤標(biāo)記物早期診斷腫瘤。通過測定和研究表明，大多數(shù)腫瘤組織細(xì)胞有較高的端粒酶表達(dá)，而且在原位癌、發(fā)育異常等端粒酶表達(dá)的頻率很高[3]。表明端粒酶是腫瘤多步驟形成過程中的早期事件。

3.3 宮頸癌中端粒酶的研究概況。Frost等應(yīng)用免疫組化（immunohistochemistry，IHC）、原位雜交（in situ hybridization，ISH）的方法研究對子宮頸癌、異型增生中hTERT/hTR表達(dá)定位研究表明癌組織、異型增生組織和正常黏膜相比，二者的表達(dá)不同，陽性細(xì)胞在癌/異型組織中增多，正常組織僅局限于基底層。但國內(nèi)，張波等用其研制HTERT單克隆抗體對宮頸癌組織進(jìn)行測試，陽性率僅為61.9%（13/21）[4]。人染色體端粒酶RNA（human telomerase RNA component，hTERC）位于3號(hào)染色體長臂，端粒酶本質(zhì)是核蛋白逆轉(zhuǎn)錄酶，作用是修補(bǔ) DNA 復(fù)制過程中損傷的端粒，可以保證端粒在細(xì)胞分裂時(shí)減少損耗，使細(xì)胞能夠持續(xù)分裂。當(dāng)端粒酶活性被激活，正常細(xì)胞得以不斷分裂，即惡性增殖，賦予細(xì)胞永生性，形成腫瘤細(xì)胞，宮頸癌就此發(fā)生。

目前，宮頸癌及其癌前病變的早期診斷主要依據(jù)HE切片光鏡下診斷，診斷具有一定的主觀性，有時(shí)與反應(yīng)性、修復(fù)性改變難以鑒別，導(dǎo)致早期診斷困難。運(yùn)用免疫組化方法檢測端粒酶活性，該技術(shù)方法成熟，操作簡單，經(jīng)濟(jì)可行，可用于臨床病理診斷，為宮頸癌的早期診斷提供客觀指標(biāo)[5]。目前已證實(shí)宮頸低級(jí)別上皮內(nèi)病變與高級(jí)別上皮內(nèi)病變是感染不同型別HPV的結(jié)果，低級(jí)別上皮內(nèi)病變是感染低危型HPV，而高級(jí)別上皮內(nèi)病變是感染高危型HPV的結(jié)果。低級(jí)別上皮內(nèi)病變相當(dāng)于CINI，而高級(jí)別上皮內(nèi)病變相當(dāng)于CINII和CINIII，實(shí)際工作中經(jīng)常會(huì)碰到難于鑒別低級(jí)別和高級(jí)別上皮內(nèi)病變的情況。因臨床對低級(jí)別和高級(jí)別上皮內(nèi)病變的處理是不同的，病理診斷準(zhǔn)確區(qū)分這兩者病變就顯得尤為重要。我們的實(shí)驗(yàn)中CINI級(jí)的病變端粒酶陽性表達(dá)率僅為14.7%，是否可以應(yīng)用端粒酶免疫表達(dá)來協(xié)助鑒別診斷一些不典型的低級(jí)別與高級(jí)別上皮內(nèi)病變，有待進(jìn)一步研究。