非受體酪氨酸激酶對糖氧剝奪誘導的少突膠質細胞凋亡的影響及其機制

張竣 張瑩 王樹坤 侯琳 袁增強,

(1 青島大學基礎醫學院，山東 青島 266071； 2 軍事醫學研究院軍事認知與腦科學研究所)

隨著社會人口的老齡化，人群缺血性腦白質病變(WMIL)發病率逐漸增高，且WMIL與神經退行性疾病密切相關[1-2]。MIL的發病機制復雜，高血壓、糖尿病、高血脂等常見的老年疾病往往會誘發MIL，其中慢性腦缺血引發的WMIL在中老年人MIL中占比極高[3-4]。對血管性癡呆患者隨訪研究發現，其發病前腦白質就已經出現血流量減少的現象[5]。WMIL患者臨床表現為認知障礙、情感障礙，患者不僅生活能力顯著下降，而且給家庭帶來沉重的負擔[6]。但是，目前WMIL尚無針對性的治療手段。腦白質中少突膠質細胞(OLs)含量豐富，且對低灌注異常敏感，極易發生缺血缺氧從而導致細胞凋亡[7]。因此，亟需進一步研究OLs缺血缺氧導致細胞凋亡的機制。

非受體酪氨酸激酶(c-Abl)廣泛表達于機體的細胞核或細胞質中，其下游底物眾多，與信號轉導、細胞黏附、細胞周期、氧化應激和DNA損傷等均密切相關[8-10]。c-Abl最初作為一種癌基因被發現，與B細胞受體融合表達引發慢性粒細胞白血病[11]。近些年來，c-Abl在神經系統中的作用越來越受到關注[12-13]。在體外培養的神經細胞中，過氧化氫可激活c-Abl，通過磷酸化哺乳動物Ste20樣激酶1/2(MST1/2)介導神經細胞的凋亡[14-15]；在阿爾茲海默病中，β-淀粉樣蛋白(Aβ)可激活c-Abl，通過磷酸化細胞抑癌因子p73導致神經元凋亡[16]；在帕金森病中，1-甲基-4苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)及1-甲基-4苯基吡啶(MPP+)均可激活c-Abl，通過磷酸化p38 Y182位點導致了多巴胺能神經元的凋亡[17]。但是，c-Abl在OLs中的作用少有報道。本研究在體外建立oli-neu和OLs糖氧剝奪(OGD)模型，初步探討c-Abl如何參與OGD介導的細胞凋亡，以揭示細胞缺血缺氧的分子機制，為WMIL的防治提供新靶點與新思路。

1 材料與方法

1.1 動物及材料

出生后3 d 的C57BL/6J乳鼠(北京斯貝福公司)；少突膠質細胞系(oli-neu)(本實驗室儲存)；DMEM/F12培養基(美國Gibco 公司)；甲狀腺素T3、多聚右旋賴氨酸(PDL)(美國Sigma公司)；c-Abl磷酸化抑制劑ABL001(美國Selleck公司)；Y245-c-Abl抗體和p-p38抗體(美國Cell Signaling Technology公司)；caspase-3抗體(武漢三鷹生物公司)；Anexin V-FITC/PI試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；CellTiter-Glo試劑盒(美國Promega公司)。

1.2 方法

1.2.1oli-neu與OLs的培養 將oli-neu接種于含體積分數0.05的胎牛血清、體積分數0.01的馬血清、體積分數0.01的鏈霉素和體積分數0.02的B27(100倍)的高糖DMEM/F12培養基中，置于37 ℃、含體積分數0.05的CO2細胞培養箱內,培養至合適密度后用于后續實驗。取生后3 d的C57BL/6J乳鼠經低溫麻醉后處死，乙醇消毒后剝離大腦半球，使用抗體吸附方法[18]獲得原代少突膠質前體細胞(OPCs)，用DMEM/F12重懸計數后均勻鋪于PDL包被的培養皿中，1.5 h后將培養基更換為OPC增殖培養基，再培養1 d后，更換為含有T3的OPC分化培養基，分化3 d后用于后續實驗。

1.2.2oli-neu細胞活力和凋亡的檢測 將oli-neu以每孔約103個均勻平鋪于96孔板中，培養36 h后，將oli-neu進行OGD處理(置于含體積分數0.05的CO2和體積分數0.1的O2的無糖培養基中培養)，分別于第0、3、6、9小時時使用CellTiter-Glo試劑盒檢測自發光強度，測定oli-neu的活力。oli-neu先分別加入等體積的二甲基亞砜(DMSO)(A組)和ABL001(100 nmol/L)(B組)進行預處理后，再經OGD處理6 h以后，測定oli-neu細胞活力。將oli-neu以每孔約106個均勻平鋪于12孔板中，培養24 h后進行OGD處理，分別于第0、3、6、9小時時使用Annexin V-FITC/PI試劑盒檢測細胞凋亡情況，細胞凋亡判斷標準：Annexin V-FITC(-)/PI(+)為壞死細胞，Annexin V-FITC(+)/PI(+)為晚期凋亡細胞，Annexin V-FITC(+)/PI(-)為早期凋亡細胞，Annexin V-FITC(-)/PI(-)為正常細胞。細胞凋亡率的計算方法為早期凋亡細胞與晚期凋亡細胞之和與總細胞的比值。

1.2.3Western blot方法檢測oli-neu和OLs中相關蛋白的相對表達量 分別將oli-neu和OLs以每孔約106個均勻平鋪于12孔板中，培養24 h后，分別進行OGD處理，并分別于第0、3、6、9 h小時時使用裂解液(提前加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑)提取總蛋白，先采用BCA試劑盒測定濃度后再進行Western blot實驗[18]。分別加入Y245-c-Abl抗體和p-p38抗體(1∶500)4 ℃孵育過夜，以β-actin作為內參照。使用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對表達量以目的蛋白灰度值/內參照蛋白灰度值計算，結果取3次實驗的均值。同時對A組、B組采用Western blot方法檢測oli-neu中Y245-c-Abl、p-p38和caspase-3蛋白的相對表達水平，其中以cleaved-caspase-3的相對表達量與pro-caspase-3的相對表達量的比值表示細胞凋亡的相對變化，實驗重復3次，取均值。于OLs中先分別加入等體積的DMSO(C組)和ABL001(100 nmol/L)(D組)進行預處理以后，再經OGD處理6 h，同樣采用Western blot方法檢測OLs中Y245-c-Abl、p-p38蛋白相對表達水平，實驗重復3次，取均值。

1.3 統計分析

2 結 果

2.1 OGD對oli-neu細胞活力和凋亡的影響

oli-neu經OGD處理第0、3、6、9小時時細胞活力分別為1.00±0.02、0.88±0.03、0.38±0.07、0.31±0.01，細胞凋亡率分別為(12.47±2.11)%、(16.82±1.31)%、(23.43±2.41)%、(35.68±3.16)%，隨著OGD處理時間的延長，細胞活力明顯下降，細胞凋亡率明顯上升(F=249.10、68.18,P<0.05)。

2.2 oli-neu和OLs經OGD處理后Y245-c-Abl和p-p38蛋白的相對表達水平比較

Western blot實驗結果顯示，oli-neu和OLs經OGD處理第0、3、6、9小時時，各時間點細胞內Y245-c-Abl、p-p38蛋白的相對表達水平比較差異均有顯著性(F=4.68～15.93，P<0.05)；在OGD處理第6小時時oli-neu內上述兩種蛋白表達水平較第0小時時顯著升高(q=3.61、4.01,P<0.05)；在OGD處理第3小時時OLs內Y245-c-Abl蛋白的相對表達水平較第0小時時顯著升高(q=2.99，P<0.05)；在OGD處理第3、6、9小時時，OLs內的p-p38蛋白的相對表達水平較第0小時時顯著升高(q=4.48～6.20，P<0.05)。結果見表1。

表1 OGD處理oli-neu和OLs不同時間點Y245-c-Abl、p-p38蛋白相對表達水平比較

2.3 ABL001預處理對oli-neu和OLs的影響

A、B組中oli-neu的細胞活力分別為0.39±0.07、0.53±0.01，細胞凋亡率則分別為(22.41±0.53)%、(18.76±1.81)%，兩組細胞活力和凋亡率比較，差異均具有顯著性(t=3.81、3.33，P<0.05)。Western blot結果顯示，A組oli-neu內Y245-c-Abl和p-p38蛋白的相對表達水平及cleaved-caspase-3/pro-caspase-3比值分別為0.74±0.02、0.83±0.06和1.04±0.05，B組分別為0.64±0.04、0.54±0.12和0.90±0.06，A、B組間上述3個指標比較差異均有顯著性(t=2.80～4.23，P<0.05)。C組OLs內Y245-c-Abl和p-p38蛋白的相對表達水平分別為0.91±0.15、0.90±0.15，D組分別為0.49±0.17、0.64±0.05，C、D組間上述2個指標比較差異均有顯著性(t=3.06、3.79，P<0.05)。

3 討 論

膠質細胞在大腦的營養傳遞、吞噬和修復等方面發揮重要作用[19-20]。OLs是中樞神經系統中的成髓細胞[21-22]。OLs沿著軸突形成髓鞘，在髓鞘間的間隔形成郎飛結來完成動作電位間跳躍式傳導，對神經元起到保護、快速傳導的作用[23-24]。此外，OLs還可通過釋放腦源性生長因子等為神經元提供營養支持，尤其是在長投射的軸突中[25-26]。OLs對神經元的保護和神經功能的維持至關重要，其功能障礙會直接導致神經元的退行性病變[27]。

腦白質具有動脈走行較長、側支循環少的供血特點，對低灌注非常敏感，容易發生缺血性病變[7]。目前臨床對WMIL尚無針對性的治療方案。本研究對oli-neu經OGD處理，結果顯示隨著OGD處理時間的延長，細胞活力顯著下降，細胞凋亡率明顯升高，提示在oli-neu經OGD處理過程中可能有多種凋亡信號被激活。

c-Abl在多物種間高度保守，且參與眾多的細胞過程，包括調控肌動蛋白細胞骨架、細胞周期以及細胞凋亡等[28-29]。在體內c-Abl結構中存在SH3-SH2-激酶結構域的發卡結構，該發卡結構通過氨基酸殘基(由豆蔻酸修飾)與激酶結構域中疏水性口袋結合，從而使c-Abl被抑制[30-31]。然而在受到外界壓力或DNA損傷時，位于SH2結構域與激酶結構域連接處的245位點被磷酸化，激活c-Abl[32]。近年來，在多種腫瘤疾病之中均發現有激活狀態的c-Abl[32-35]。而在神經退行性疾病中，活性氧可以調節c-Abl的活性，介導細胞死亡。c-Abl是否也參與到OGD誘導的oli-neu凋亡過程尚不清楚。本研究的結果顯示，在OGD處理第6小時時oli-neu內c-Abl被顯著激活，經ABL001預處理，再經OGD處理6 h后，oli-neu細胞凋亡率降低，提示c-Abl與OGD誘導的oli-neu細胞凋亡密切相關。絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)在響應外界壓力刺激中非常重要。在真核細胞中，有幾條平行的MAPK信號通路以響應不同的刺激，其中p38MAPKs主要由炎癥因子和外界壓力激活，在多個生理過程中發揮重要作用。在先前研究中，c-Abl在MPTP誘導的帕金森模型中被激活，激活的c-Abl直接磷酸化p38并介導多巴胺神經元凋亡[17]。本研究通過ABL001抑制了OGD誘導的細胞內c-Abl磷酸化的同時，也抑制了p38的磷酸化，提示c-Abl-p38信號通路也參與了OGD誘導的oli-neu的凋亡。

由于原代細胞在研究分子機制中具有不可替代的作用，并且其在體外的發生發展與體內更加相近。因此，本研究對原代培養的OLs進行OGD處理，以驗證c-Abl-p38信號通路是否也介導了原代OLs的凋亡。結果顯示，OLs經過ABL001預處理，再經OGD處理6 h后，c-Abl激酶活性被抑制，同時p38的磷酸化水平也下降，提示在原代OLs的OGD模型中也存在c-Abl-p38信號通路的激活。然而p38下游底物眾多，介導不同的生物學功能。在OGD誘導的原代神經元凋亡中，p38抑制劑SB203580通過抑制p38的磷酸化發揮抗凋亡作用[36]。研究發現，在星形膠質細胞OGD/復氧(OGD/R)導致的細胞水腫中，通過抑制p38的激活降低了水通道蛋白4(AQP4)的表達，從而減輕了細胞的水腫[37]。人趨化因子CX3CL1和其受體CX3CR1介導小膠質細胞激活，通過p38MAPK/PKC信號通路在缺血性腦損傷中發揮負面作用[38]。然而在本研究中，p38如何介導其下游的底物參與OGD誘導的OLs凋亡尚不清楚，有待進一步深入探討。

總之，本研究結果顯示c-Abl參與了OGD誘導的oli-neu和OLs凋亡過程，而c-Abl抑制劑可以減輕細胞凋亡，其促進凋亡的機制可能是通過c-Abl-p38通路介導的。c-Abl有望成為WMIL新的治療靶點,并為慢性WMIL的防治提供新的思路。但是c-Abl在體內如何發揮作用還有待深入探究。