基于環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增技術(shù)的巴戟天檢測方法的建立

王姝涵 隋愛華 韓亞斐 周泉 許行 姚如永

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究中心，山東 青島 266003)

巴戟天(MorindaofficinalisHow)為茜草科巴戟天屬藥用植物，主產(chǎn)于廣東、廣西等地[1]。其干燥根作為四大南藥之一，在傳統(tǒng)中醫(yī)藥中具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕等功效[2]。巴戟天的活性成分主要為環(huán)烯醚萜苷、蒽醌和糖類等[3-5]，具有抗不孕不育、抗抑郁和抗骨質(zhì)疏松等作用[6-9]。常與巴戟天混淆的藥材羊角藤、鐵箍散、虎刺等在外部形態(tài)上與巴戟天極為相似，但藥用價值和有效成分差異很大，選擇不當(dāng)將引起不良反應(yīng)，影響臨床用藥安全[10]。根據(jù)藥典標(biāo)準(zhǔn)，巴戟天的鑒定方式為顯微鑒別、色譜分析等[11]，但這些鑒定方式存在靈敏度不夠、耗時較長、設(shè)備昂貴等弊端[12-13]，因此臨床迫切需要一種靈敏、快速、成本較低的巴戟天鑒定技術(shù)。環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增(LAMP)技術(shù)是一種較為新穎的核酸擴(kuò)增技術(shù)，由NOTOMI等[14]于2000年建立。在特異性引物、鏈置換型DNA聚合酶的作用下，靶基因于恒溫條件15～60 min即可完成擴(kuò)增反應(yīng)[15]。加入熒光染料可通過明顯的顏色變化客觀判定檢測結(jié)果[16]，通過實(shí)時濁度儀或?qū)崟r熒光定量儀可對反應(yīng)過程進(jìn)行實(shí)時定量監(jiān)測[17]。目前LAMP檢測已廣泛應(yīng)用于臨床診斷、病原體檢測、病蟲害排查等[18-20]，但尚未見巴戟天LAMP檢測相關(guān)的研究報道[21]。DNA條形碼是一種常用的分子鑒定工具，廣泛應(yīng)用于植物鑒定[22-23]。巴戟天二級內(nèi)部轉(zhuǎn)錄空間(ITS2)序列是該物種最具特異性的標(biāo)記序列之一，具有高度種間變異性和區(qū)分度[24-25]。本研究擬建立一種基于LAMP技術(shù)針對巴戟天ITS2序列的簡便、快速、價廉檢測方法，為巴戟天DNA分子鑒定提供新方式。

1 材料與方法

1.1 材料

選取巴戟天及與其外形或基因相似度較高的7種藥材，分別為羊角藤(MorindaumbellataL.)、虎刺(Damnacanthusindicus)，鐵箍散(Schisandrapropinquavar.Sinensis)、海濱木巴戟(Morinda

citrifoliaL.)、雞眼藤(Morindaparvifolia)、白木通(Akebiatrifoliatasubsp.Australis)、南五味子(KadsuralongipedunculataFinetetGagnep)。巴戟天及其相似藥材均來自青島大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，并經(jīng)專業(yè)醫(yī)師按藥典標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行鑒定，使用前均置于干燥環(huán)境下常溫貯存。

1.2 DNA提取

將上述藥材磨成粉末，并按照Sangon Biotechs Ezup柱式植物基因組DNA提取試劑盒的說明書要求的步驟分別提取總DNA，使用QuickDrop分光光度計(jì)檢測所提取DNA的純度和濃度。選出A260/A280比值高于1.80的DNA提取液，經(jīng)TE緩沖溶液稀釋使其終濃度為10 mg/L，置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 生物信息學(xué)分析

在NCBI(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov)的GenBank數(shù)據(jù)庫中，通過Blast分析篩選出與巴戟天ITS2序列相似度>90%的基因序列，然后使用MEGA 7軟件進(jìn)行1 000次最大似然樹比對，確定巴戟天LAMP檢測的最適ITS2靶標(biāo)序列，用于后續(xù)引物設(shè)計(jì)。

1.4 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)生物信息學(xué)分析結(jié)果，利用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer 5.0 (http：//primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)設(shè)計(jì)LAMP引物，將符合標(biāo)準(zhǔn)的引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成，引物設(shè)計(jì)的標(biāo)準(zhǔn)為：GC含量范圍為40%～60%，預(yù)測的熔化溫度(Tm)范圍為0～65 ℃，ΔG≤4 kcal/mol。引物序列見表1。

表1 巴戟天LAMP檢測引物

1.5 最適反應(yīng)溫度的確定

按照Loopamp?DNA熒光目視等溫擴(kuò)增試劑盒的說明書冰上制備25 μL反應(yīng)混合體系，其中的DNA提取液濃度為10 mg/L。于該體系中加入1 μL鈣黃綠素作為目視檢測的反應(yīng)體系，混勻后使用水浴鍋在58 ℃、60 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、66 ℃、68 ℃的反應(yīng)溫度下分別進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增60 min后，80 ℃滅活10 min。擴(kuò)增成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)為原橘色反應(yīng)液肉眼觀察變?yōu)榫G色。根據(jù)綠色的深淺判斷最適反應(yīng)溫度，綠色越深，說明產(chǎn)物的量越多，反應(yīng)溫度越適宜。

同時以實(shí)時熒光定量方法檢測擴(kuò)增時的熒光強(qiáng)度，驗(yàn)證基因擴(kuò)增結(jié)果。制備上述25 μL反應(yīng)混合體系，體系中加入1 μL SYBR GREEN Ⅰ(北京索萊寶科技有限公司)作為實(shí)時定量檢測的反應(yīng)體系，混勻以后使用熒光定量PCR儀(LineGene 9600，杭州博日科技有限公司)在58 ℃、60 ℃、62 ℃、63 ℃、64 ℃、66 ℃、68 ℃的不同循環(huán)段溫度下分別進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)。條件設(shè)置為循環(huán)段：60個循環(huán)，每個循環(huán)1 min；熔解段：80 ℃循環(huán)10 min。擴(kuò)增成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)為反應(yīng)時有擴(kuò)增曲線生成。根據(jù)曲線到達(dá)的熒光強(qiáng)度判斷最適反應(yīng)溫度，熒光強(qiáng)度數(shù)值越高，說明產(chǎn)物的量越多，反應(yīng)溫度越適宜。

1.6 特異性檢測

將巴戟天與羊角藤、虎刺、鐵箍散、海濱木巴戟、雞眼藤、白木通、南五味子的DNA提取液及TE緩沖溶液(陰性對照)，按照1.5所述方法，并使用最適反應(yīng)溫度進(jìn)行擴(kuò)增，同時進(jìn)行目視以及實(shí)時定量LAMP檢測，評價該方法的特異性。

1.7 靈敏度檢測

將濃度10 mg/L的巴戟天DNA提取液稀釋至100.00、10.00、1.00、0.10、0.01 μg/L后按照1.5所述方法，同時進(jìn)行目視及實(shí)時熒光定量LAMP檢測，確定LAMP的靈敏度。

將稀釋為100.00、10.00、1.00、0.10、0.01 μg/L的巴戟天DNA提取液按照TaKaRa Ex Taq?DNA聚合酶的說明書進(jìn)行常規(guī)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增，擴(kuò)增引物使用表1中F3和B3各40 pmol，終體積為25 μL。用20 g/L瓊脂糖凝膠電泳成像法檢測水浴LAMP方法擴(kuò)增結(jié)果和常規(guī)PCR方法擴(kuò)增結(jié)果，比較兩種方法的靈敏度。擴(kuò)增成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)為凝膠上有條帶產(chǎn)生，其中LAMP方法擴(kuò)增的條帶為梯形特征條帶，PCR方法擴(kuò)增的條帶為200～300 bp間顯示的常規(guī)條帶。

2 結(jié) 果

2.1 物種比對結(jié)果

最大似然樹比對結(jié)果顯示，巴戟天AB715224序列獨(dú)立聚為一支，與其他物種進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，物種分離清晰，說明這一序列具有良好的物種鑒別能力。見圖1。圖中物種名稱后面括號內(nèi)為所對應(yīng)的基因序列號，連線處的數(shù)字為置信度。

圖1 巴戟天及近緣植物基于ITS2序列的最大似然樹

2.2 巴戟天LAMP檢測的最適反應(yīng)溫度篩選結(jié)果

目視檢測結(jié)果顯示，反應(yīng)溫度為58 ℃時反應(yīng)液顏色顯示為橘色，沒有擴(kuò)增成功。其余反應(yīng)溫度時反應(yīng)液均為綠色且顏色相近，說明擴(kuò)增成功但無法判斷出最適反應(yīng)溫度。見圖2A。實(shí)時熒光定量分析結(jié)果顯示，反應(yīng)溫度為63 ℃時曲線顯示擴(kuò)增最明顯，擴(kuò)增的熒光強(qiáng)度最高。由此確定巴戟天LAMP檢測在58～68 ℃范圍內(nèi)的最適反應(yīng)溫度為63 ℃。見圖2B。

A：目視檢測結(jié)果，B：實(shí)時熒光定量檢測結(jié)果圖2 巴戟天LAMP檢測最適反應(yīng)溫度篩選

2.3 巴戟天LAMP檢測的特異性結(jié)果

巴戟天與其他7個物種的LAMP目視檢測結(jié)果顯示，陰性對照與其他物種的反應(yīng)液均為橘色，顯示沒有擴(kuò)增。含有巴戟天DNA的反應(yīng)液由橘色變?yōu)榫G色，說明擴(kuò)增成功。見圖3A。實(shí)時熒光定量分析結(jié)果顯示，陰性對照與其他物種無擴(kuò)增曲線生成，顯示沒有擴(kuò)增。含有巴戟天DNA的反應(yīng)液生成了擴(kuò)增曲線，說明擴(kuò)增成功。見圖3B。

A：各物種的目視檢測結(jié)果，B：各物種的實(shí)時熒光定量檢測結(jié)果。其中1～9分別為陰性對照、巴戟天、羊角藤、虎刺、鐵箍散、海濱木巴戟、雞眼藤、白木通、南五味子圖3 各物種LAMP檢測結(jié)果

2.4 巴戟天LAMP檢測的靈敏度

目視檢測結(jié)果顯示，巴戟天DNA提取液的濃度為0.01 μg/L時反應(yīng)液顏色顯示為橘色，沒有擴(kuò)增成功。其余濃度的反應(yīng)液均由橘色變?yōu)榫G色，說明擴(kuò)增成功。見圖4A。實(shí)時熒光定量分析結(jié)果顯示，巴戟天DNA提取液的濃度為0.01 μg/L時無擴(kuò)增曲線生成，顯示沒有擴(kuò)增。其余濃度均生成了擴(kuò)增曲線，說明擴(kuò)增成功。見圖4B。由此確定巴戟天LAMP檢測的最低檢測限約為0.10 μg/L

A：目視檢測結(jié)果，B：實(shí)時定量檢測結(jié)果圖4 不同濃度巴戟天DNA提取液的LAMP檢測結(jié)果

凝膠電泳成像檢測結(jié)果顯示，常規(guī)PCR方法擴(kuò)增巴戟天DNA提取液的濃度為0.10 μg/L，無條帶產(chǎn)生，沒有擴(kuò)增成功；其余濃度在200～300 bp間產(chǎn)生條帶，說明擴(kuò)增成功。見圖5A。LAMP方法擴(kuò)增巴戟天DNA提取液的濃度為0.01 μg/L時，無條帶產(chǎn)生，沒有擴(kuò)增成功；其余濃度均生成了梯形條帶，說明擴(kuò)增成功。見圖5B。因此可以確定巴戟天常規(guī)PCR檢測的最低檢測限約為1.00 μg/L。

A：常規(guī)PCR方法擴(kuò)增檢測結(jié)果；B：LAMP方法擴(kuò)增凝膠電泳成像檢測結(jié)果。其中1～5分別為100.00、10.00、1.00、0.10、0.01 μg/L，M為DNA marker圖5 不同濃度巴戟天DNA提取液的凝膠電泳成像檢測結(jié)果

3 討 論

包含中藥及其提取成分的醫(yī)藥產(chǎn)品在疾病的預(yù)防和治療中的使用越來越廣泛，誤用、混用和假冒中藥將嚴(yán)重影響臨床用藥安全[26]。本研究從基因角度基于LAMP技術(shù)建立簡便快捷、特異性強(qiáng)、靈敏度高的巴戟天檢測方法，為巴戟天分子鑒定提供新的檢測思路，解決了巴戟天及其表型與其相同、化學(xué)成分較相似的近緣物種鑒定困難的問題。

本研究基于巴戟天ITS2序列設(shè)計(jì)引物，該序列具有序列分歧度最小、遺傳變異系數(shù)最大、序列較為保守的特征[27]。最大似然樹比對結(jié)果顯示，ITS2序列在巴戟天的系統(tǒng)研究和種屬鑒定方面具有很大潛力，可能是最適合巴戟天種屬的鑒定序列。

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，巴戟天LAMP檢測的最適反應(yīng)溫度為63 ℃，而且僅需水浴60 min左右即可完成對巴戟天DNA的擴(kuò)增，反應(yīng)完成后生成大量核酸并產(chǎn)生明顯的顏色變化，檢測結(jié)果清晰客觀。因此巴戟天LAMP檢測可簡單有效地依據(jù)試管內(nèi)反應(yīng)液顏色變化進(jìn)行目視定性檢測，克服瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果易被污染且檢測步驟繁瑣的缺點(diǎn)。

巴戟天及其近緣物種LAMP檢測的特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，巴戟天可在本研究選擇的樣本范圍內(nèi)成功檢測出巴戟天，具有較好的特異性。因此，該方法的應(yīng)用性良好，可為茜草科植物的中藥檢測方法研究提供一定的參考價值。

根據(jù)靈敏度檢測結(jié)果，該方法的最低檢測限約為0.10 μg/L，約為常規(guī)PCR方法最低檢測限的十分之一，顯示了較高的靈敏度。這一結(jié)果提示，巴戟天LAMP檢測方法有不低于同類型分子檢測方法的靈敏度。

本研究的不足之處在于，植物尤其是含水、含糖量較多的植物，其DNA提取過程有時比較困難，而在分子檢測領(lǐng)域的分析過程中，DNA提取失敗等問題會影響檢測靈敏度[28-29]。保證DNA提取質(zhì)量，進(jìn)一步探索高質(zhì)量、高效率提取植物DNA的技術(shù)方法，是需要著力解決的方向之一。

綜上，巴戟天LAMP檢測具有良好的特異性、靈敏度和應(yīng)用性，同時適配于PCR相關(guān)設(shè)備，根據(jù)凝膠成像和實(shí)時熒光定量擴(kuò)增曲線得到半定量和定量的結(jié)果。因此該方法可利用現(xiàn)有各類設(shè)施，適合各級各類藥品檢測機(jī)構(gòu)，應(yīng)用前景廣闊[30]，下一步可結(jié)合側(cè)向流試紙條開發(fā)巴戟天即時檢測(POCT)試劑盒以推廣使用[31]。