基于網絡藥理學方法探討香附治療肝癌的作用機制*

張慕垚，譚曉慧，王振飛，耿剛

1.內蒙古醫科大學，內蒙古 呼和浩特 010100；2.內蒙古腫瘤醫院，內蒙古 呼和浩特 010020；3.內蒙古自治區中醫醫院，內蒙古 呼和浩特 010010

肝癌是世界上發病率和死亡率最高的惡性腫瘤之一。2020年美國癌癥統計報告顯示，美國男性和女性的肝癌及肝內膽管癌死亡率分別為6%和4%［1］，2018年中國男性肝癌診斷率為12.4%、死亡率為15.2%。由于病毒感染引起的肝癌得到了一定的防控［2］，但轉移率和死亡率仍然較高，嚴重威脅著人民的健康。中醫藥在抗腫瘤方面積累了豐富的臨床經驗，中藥以多途徑、多靶點抑制肝癌的發生發展，在臨床治療中優勢突出。

香附，別名莎草、香頭草、回頭青、雀頭香、雷公頭、三棱草根等，是莎草科植物莎草的干燥根莖，主產于我國浙江、山東、福建、湖南、安徽一帶。味辛、微苦微甘、平，歸肝、脾和三焦經，具有疏肝解郁、理氣寬中、調經止痛的功效［3］，可用于治療肝郁氣滯、脅肋脹痛、脘腹疼痛、月經不調、黃疸、疝氣等疾病。藥理研究顯示，該藥具有抗腫瘤作用［4－5］，但目前對抗腫瘤活性成分和作用的分子機制知之甚少。本研究采用網絡藥理學的方法分析香附抗肝癌作用的活性成分，尋找活性成分的作用靶點及通路，為該藥的深度開發及抗肝癌臨床應用提供理論依據。

1 方法

1.1 香附活性成分的獲取在TCMSP數據庫檢索到香附的全部活性成分，根據生物利用度（oral bioavailability，OB）＞30%和類藥性（durgliness，DL）＞0.18的條件篩選出有效活性成分。下載藥物相關的所有靶點，用Perl軟件將上述有效成分相關的靶點在所有靶點中篩出，通過Uniprot數據庫將已篩選出的靶點名轉換為靶點Symbol，標準化處理以便后續操作。

1.2 肝癌靶點的獲取在GeneCards數據庫（https：／／www.genecards.org／）中以“Liver cancer”為關鍵詞進行檢索，導出所有肝癌相關靶標，以Relevance score＞1的條件進行篩選，得到與肝癌關聯性較大的靶標。在OMIM數據庫（https：／／www.omim.org／）中Gene Map內以“Liver cancer”為關鍵詞進行檢索，導出所有肝癌相關靶標。將兩個數據庫檢索得到的靶標匯總，摘取Symbol備用。

1.3 確定香附－肝癌的共同靶點應用韋恩圖在線 工 具（http：／／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／Venn／）將1.1和1.2獲取的香附與肝癌的靶點Symbol取交集，得到香附與肝癌的共同靶點，繪制韋恩圖，保存交集文件。

1.4 香附－活性成分－肝癌－靶點關系網絡構建用Cytoscape 3.7.0軟件構建香附治療肝癌的關系網絡圖。打開Cytoscape導入前期準備好的相關文件，繪制網絡圖，調整圖片顏色格式大小等參數，導出圖片，得到“香附－活性成分－肝癌－靶點”的關系網絡。

1.5 PPI蛋白互作網絡構建及柱狀圖繪制運用STRING（https：／／string－db.org／）在線分析軟件，找到Multiple proteins，在List Of Names中輸入香附與肝癌的靶點Symbol交集文件，物種選擇人（即Homo Sapiens），點擊search、continue，默認最小的score為0.4，得到PPI蛋白互作網絡圖。用R語言計算節點連線與連接基因的數目，取數目最多的前30個基因繪制柱狀圖。

1.6 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析用R語言香附中有效活性成分治療肝癌的靶基因進行GO生物過程富集分析和KEGG通路富集分析，設置P＜0.05，Q＜0.05，物種為人，分析結果以柱形圖和氣泡圖的形式予以展示。

2 結果

2.1 香附活性成分及作用靶點按OB＞30%和DL＞0.18的條件篩選出的香附活性成分18個，見表1。香附所有活性成分的相關治療靶點1029個，用perl找出18個成分所作用的靶點496個，將這些靶點名在Uniprot數據庫中轉化為Symbol，得到231個靶點Symbol。

表1 香附的活性成分

2.2 香附－肝癌靶點香附活性成分作用靶點231個，刪除重復，剩余108個。由GeneCards、OMIM數據庫檢索整合肝癌靶點15 392個，去除重復靶點，剩余14 248個。將香附活性成分作用靶點與肝癌靶點取交集得到香附－肝癌靶點105個，見圖1。

圖1 香附靶點與肝癌靶點韋恩圖

2.3 香附－活性成分－肝癌－靶點關系網絡構建運用Cytoscape 3.7.0軟件構建香附治療肝癌的“香附－活性成分－肝癌－靶點”關系網絡圖，見圖2。紅色菱形表示肝癌，藍色橢圓形代表香附，黃色四邊形代表活性成分，綠色三角形表示靶點。該網絡共包括有效成分16個，節點105個，成分靶點間共存在333條相互作用關系。通過香附治療肝癌關系網絡可視化，可知香附的一種有效成分可作用于多個肝癌的靶點，同一個肝癌的靶點也可受多個有效成分調控。

圖2 香附－活性成分－肝癌－靶點關系網絡圖

2.4 PPI蛋白互作網絡及柱狀圖該PPI網絡包含節點105個，邊937條，平均節點度17.8，平均局部聚類系數0.584，PPI富集P＜1.0e－16。網絡節點代表了蛋白質，其大小和顏色的深淺代表度值大小，節點度值越大代表節點在網絡中越處于核心地位，邊粗細代表score大小，這里默認最小score為0.4。節點連線與連接因子數目最多的前30個因子，如圖3、圖4。節點因子鄰接的因子越多，說明該因子在網絡中越核心。其中白細胞介素（interleukin－6，IL－6）與周圍因子連接最多有58個，血管內皮生長因子A和凋亡信號分子CASP3均有54個，絲裂原激活蛋白激酶8有53個，表皮生長因子受體有52個，說明香附治療肝癌與這些因子關系密切。

圖3 香附－肝癌靶點PPI蛋白互作網絡圖

圖4 香附－肝癌靶點PPI蛋白互作柱狀圖

2.5 GO功能富集分析圖5為GO分析的前20個結果的柱狀圖，縱坐標代表基因的生物學功能，橫坐標代表富集的基因數目；圖6為GO分析的前20個結果的氣泡圖，縱坐標代表基因的生物學功能，橫坐標代表富集的基因比例，氣泡的大小表示富集的數目。所涉及的生物學功能包括DNA結合轉錄激活劑活性、特異性RNA聚合酶II、DNA結合轉錄因子結合、神經遞質結合、泛素樣蛋白連接酶結合等。香附可能是通過作用影響這些關鍵生物學功能而發揮治療肝癌作用的。

圖5 GO功能富集分析柱狀圖

圖6 GO功能富集分析氣泡圖

2.6 KEGG通路富集分析圖7為KEGG分析的前20個結果的柱狀圖，縱坐標代表基因通路，橫坐標代表富集的基因數目；圖8為KEGG分析的前20個結果的氣泡圖，縱坐標代表基因通路，橫坐標代表富集的基因比例，氣泡的大小表示富集的數目。所涉及的生物學通路包括PI3K－Akt信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、MAPK信號通路、甲狀腺激素信號通路等，所涉及的生物學過程包括人巨細胞病毒感染、Kaposi肉瘤相關皰疹病毒感染、乙型肝炎、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、細胞凋亡等，這些信號通路與生物學過程富集程度較高，說明與香附治療肝癌的作用關系密切。

圖7 KEGG通路富集分析柱狀圖

圖8 KEGG通路富集分析氣泡圖

圖9 為KEGG通路分析得到的腫瘤壞死因子通路，紅色表示與香附有效活性成分作用于肝癌相關的因子或分子。

圖9 腫瘤壞死因子通路

3 討論

香附出自《名醫別錄》，李時珍曰：“《別錄》止云莎草，不言用苗用根。后世皆用其根，名香附子”。《本草簡要方》“利三焦，解六郁，平怒氣，消飲食，通一切氣”。《本草備要》稱香附“乃血中氣藥，通行十二經”。尤可看出香附的行氣之功。《外科十法》和《醫方簡義》均記載了香附治療乳腺癌“敷乳巖，實時消散”“治乳癰乳巖初起者”。肝主疏泄，主藏血，喜調達而惡抑郁，肝郁則氣滯，氣滯則痰凝血瘀，日久聚而成毒形成為積聚。香附歸足厥陰肝經，善于疏肝解郁，尤其適用于肝郁氣滯證的疾病。現代醫家用香附疏肝解郁的功效配伍其他中藥治療多種惡性 腫瘤（如 肝癌、乳腺 癌）［6－9］及相關 并發癥［10－12］（如癌性胸水、抑郁癥）。

本研究得到的香附活性成分如異鼠李素、β－谷甾醇、木樨草素和槲皮素等，已經證實這些活性成分具有抗腫瘤的作用。Cai Fangzhen等［13］研究發現，異鼠李素可通過靶向作用于線粒體依賴的內源性凋亡生物學過程、增強間充質上皮轉化和抑制基質金屬蛋白酶（MMP）2（MMP－2）和MMP－9的過度表達、下調癌細胞p－P13K、p－Akt和p－mTOR蛋白表達來抑制PI3K／Akt／mTOR生物學途徑，從而抑制雄激素非依賴性前列腺癌細胞的生長、增殖和轉移。嚴寧等［14］研究發現，β－谷甾醇可降低大鼠血清中丙二醛、超氧化物歧化酶、活性氧等參與氧化應激，降低模型大鼠血清中IL－1β、IL－6和TNF－α的炎性因子水平，通過下調ERK1／2、上調Bcl－2／Bax，參與ERK1／2信號通路（如細胞凋亡和癌變等生物學活動）來抑制心肌缺血再灌注損傷。木樨草素也是重要的抗癌活性成分，董欣敏等［15］研究發現，木樨草素可抑制乳腺癌細胞MDA－MB－231的增殖并誘導其凋亡。Iva Potocnjak等［16］研究發現，木樨草素降低抗凋亡蛋白Bcl－2的表達、增加促凋亡蛋白Bax和caspase－3的表達來促進癌細胞凋亡，增加自噬蛋白Beclin－1、自噬相關蛋白5（Atg5）和微管相關蛋白1A／1B輕鏈3β－I／II（LC3B－I／II）的表達來促進癌細胞自噬，抑制（Wnt）／β－catenin途徑誘導上皮－間質轉化過程的逆轉。槲皮素能抑制腫瘤細胞的生成和轉移，主要調節了以下幾種細胞生物學過程和傳導途徑：細胞周期停滯、細胞凋亡、NF－κB途徑、AKT／mTOR信號通路、p38MAPK信號通路和PI3K－AKT信號通路［17－19］等。本研究運用網絡藥理學分析得到香附通過多成分、多靶點抗肝癌的網絡關系，找到了IL－6、血管內皮生長因子A、凋亡信號分子CASP3、絲裂原激活蛋白激酶8和表皮生長因子受體等關鍵的靶分子。此外，目前對金圣草（黃）素、異黃檀素、玫瑰菌素等物質的抗癌活性還研究較少，通過藥物疾病靶點互作網絡的構建與分析，得知這些活性成分可能作用于ESR1、AR、PPARG、NCOA2等基因，進而參與核受體活性、配體激活轉錄因子活性、類固醇激素受體、DNA結合轉錄因子結合和DNA結合轉錄激活活性等生物學過程發揮抗肝癌的作用，這些結果可為今后研發新的抗肝癌藥物提供新的思路。

本研究通過GO功能富集分析，得到所涉及的生物學功能主要包括DNA結合轉錄因子結合、DNA結合轉錄激活活性、RNA聚合酶II特異性、泛素樣蛋白連接酶結合、神經遞質結合、氧化還原酶活性、與分子氧結合或還原等。表明香附中的活性成分通過參與DNA轉錄，神經遞質結合和氧化反應等過程治療肝癌。通過KEGG的通路富集分析，主要涉及有PI3K－Akt信號通路、MAPK信號通路、AGERAGE信號通路、腫瘤壞死因子信號通路及甲狀腺激素信號通路等；主要涉及的生物學過程包括人巨細胞病毒感染、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、MicroRNAs調控、流體剪切應力與動脈粥樣硬化、癌癥中的蛋白多糖等，這些病毒感染和途徑的激活與肝癌關系密切。磷脂酰肌醇－3－激酶（PI3K）／蛋白激酶B（Akt）信號通路是調節機體內細胞生存、生長、分化及凋亡的重要信號通路，其過程是催化相關蛋白的磷酸化發揮促癌作用［20］，如miR－182可通過激活PI3K／AKT信號通路上調其相關蛋白的表達（如MMP－9、c－Myc、VEGF），從而促進肝癌細胞的增殖、侵襲和遷移［21］。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）被激活后參與細胞的增殖、分化、凋亡和自噬等過程，因此MAPK信號通路作為經典的途徑，在其相關蛋白（細胞外信號調節激酶、c－Jun氮末端激酶以及p38激酶）在磷酸化后可發揮抑癌作用［22］。乙肝病毒所表達的乙肝病毒X蛋白（HBx）可激活NF－κB通路，使轉錄因子NF－κB活化來調節肝癌細胞的遷移、侵襲［23］；還有研究發現，在乙肝病毒相關的肝細胞肝癌患者的腫瘤樣品中觀察到miR－200c低表達［24］。研究證實，人巨細胞病毒感染與惡性腫瘤相關［25］，如人巨細胞病毒感染可能通過STAT3信號通路上調內皮細胞特異性分子的表達促進膠質瘤的發展［26］；人巨細胞病毒的US28基因可能激活HIF－1α途徑、調節下游遷移及侵襲基因表達從而促進結腸癌細胞的遷移、侵襲［27］。流體剪切應力是通過血液在血管中持續流動，對血管內皮細胞產生剪切力，激活膜感受器和細胞內信號轉導（如核因子κB、MAPK、血小板內皮黏附分子等）而調控基因表達，從而影響血管內皮細胞的功能來調節血管張力、血液黏附性、凝血和纖溶間的平衡等［28］，從改變血液循環方面改善腫瘤微環境。

本研究具體展示了腫瘤壞死因子通路分析圖（如圖8），腫瘤壞死因子與細胞膜上腫瘤壞死因子受體結合，作用于TRADD蛋白（TRAF2／5和R1P1），與銜接蛋白（TAB1／2／3）和轉化生長因子激酶1（TAK1）磷酸化MKK4／7和MKK3／6；MKK4／7使JNK1／2蛋白磷酸化作用于激活子蛋白－1（AP－1）參與DNA的轉錄。TAB1／2／3和TAK1還可以使IKKβ磷酸化，激活核轉錄因子NF－κB和Tp12，進而磷酸化MEK1，使細胞外調節蛋白激酶（ERK1／2）磷酸化，通過MSK1／2作用于基因轉錄蛋白CREB參與DNA的轉錄。DNA轉錄進一步調控IL－6、Nfkbia基因、Fos等因子的表達，影響肝癌的發生發展。而香附的有效活性成分作用于IKKβ、NF－κB、JNK1／2蛋白和AP－1發揮對肝癌的治療作用。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學的方法得到香附共16個有效活性成分作用于108個靶點，有105個靶點與肝癌的靶點有交集，構建了香附－活性成分－肝癌－靶點關系可視化網絡（成分靶點間共存在333條相互作用關系）和PPI蛋白互作可視化網絡（節點105個，邊937條），通過GO功能富集和KEGG通路富集分析找到香附治療肝癌涉及的相關生物學功能和通路并進行注釋，提示香附通過多靶點、多通路發揮抗肝癌的作用，證明了在中醫學理論的指導下中藥抗癌的科學性。