非小細胞肺癌CT灌注參數與VEGF、HIF-1α、Ki-67的相關性研究

陳佳莉，馮琨，劉曉雯，張晗，林黛英，步軍

肺癌是發病率、病死率最高的腫瘤，占總惡性腫瘤新發病例的13%[1-2]。非小細胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)是最常見的肺癌類型，約占所有肺癌的80%[3]，NSCLC中最常見的是腺癌和鱗癌。大多數NSCLC患者發現時為中晚期，失去手術切除的機會，此時放化療是其主要治療方案。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)促進腫瘤血管增生，缺氧誘導因子1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)在缺氧狀態下表達增多，細胞增殖核抗原(nuclear-associated antigen，Ki-67)可反映腫瘤細胞的增殖能力。因此，本研究通過探討NSCLC的CT灌注成像(CT perfusion imaging，CTPI)參數與VEGF、HIF-1α與Ki-67的關系，可以通過CT灌注無創性獲得肺癌組織中的分子指標表達情況，為肺癌分子靶向治療的動態監測提供幫助。

材料與方法

1.一般資料

搜集2018年2月-2018年12月在廣州市紅十字會醫院住院行64層螺旋CT胸部灌注掃描并經病理證實為NSCLC的患者24例，腺癌17例，鱗癌7例，男21例，女3例，平均年齡(64.88±10.00)歲，病灶最大徑1.1～9.0 cm，平均(4.34±2.08) cm，平掃病灶實性部分平均CT值(41.92±9.73) HU。

所有患者均簽署知情同意書，本研究得到醫院倫理委員會許可。

納入標準：①CT常規掃描顯示肺內單發直徑大于1 cm的實性腫物患者；②排除其他部位原發腫瘤病史；③未經臨床治療；④穿刺或者手術病理證實為NSCLC并行VEGF、HIF-1α、Ki-67免疫組化檢查。

排除標準：①呼吸頻率過快，經呼吸訓練控制后仍不能配合檢查者；②因各種原因未進行手術切除或無法耐受CT引導下穿刺活檢，未取得病理結果；③病理結果為炎性病變、結核球；④腫塊壞死嚴重，興趣區內不能測得完整的灌注參數；⑤穿刺組織過少無法進行免疫組化檢查。

2.CT灌注檢查方法

患者準備：①向患者詳細說明檢查目的、方式，詢問有無檢查禁忌證、碘劑過敏史，簽署知情同意書；②對患者進行呼吸訓練，指導患者練習吸氣后屏氣，要求在掃描中重復屏氣的呼吸深度相同。

掃描方法：采用荷蘭Philips Brilliance 64 CT掃描儀，對比劑采用優維顯(Ultravist，300 mg I/mL，德國拜耳先靈公司)。先行全肺常規 CT 平掃，檢查范圍自胸廓入口至雙側肋膈角水平，全程患者平靜呼吸。掃描參數：管電壓120 kV，管電流200 mAs，矩陣512×512，螺距0.795，層厚3 mm。灌注掃描：選取平掃病灶最大截面為灌注掃描的中心層面，然后用高壓注射器經肘靜脈注射優維顯50 mL，流率為5 mL/s，延遲5 s后開始灌注掃描，總灌注掃描時間約30 s。掃描參數：管電壓120 kV，管電流100 mAs，矩陣512×512，掃描時間1 s/轉，層厚2.5 mm，準直器64×0.625。

圖像后處理及數據分析：將掃描的圖像傳送至Philips Extended BrillianceTM WorkspaceXXX工作站，采用Philips CT Perfusion軟件包進行分析。選取病灶實性成分最大層面進行分析，先在主動脈上手動勾畫ROI(若該層面無主動脈則選取頸總動脈)，接著勾畫病灶ROI，生成偽彩圖和灌注指標，包括灌注值(Perfusion)、血容量(blood volume，BV)、強化峰值(peak enhancement image，PEI)及達峰時間(time to peak，TTP)，見圖1。兩位副主任醫師基于同一組灌注圖像，通過相同的方法獲得灌注參數值，并將其均值作為統計結果。病灶ROI的選擇：手動繪制ROI，在避開壞死、大血管、含氣區域、偽影等，盡量選取或包含較大范圍的腫瘤組織[4]。

3.免疫組化測定方法

采用SP二分法測定NSCLC組織中的VEGF、HIF-1α、Ki-67表達情況。采用福州邁新生物技術有限公司即用型鼠抗人VEGF單克隆抗體(克隆號：VG1)、即用型鼠抗人Ki-67單克隆抗體(克隆號：MIB-1)，碧云天生物有限公司即用型鼠抗人HIF-1α單克隆抗體(克隆號：H1α67)。石蠟切片水化，進行抗原修復，接著滴加一抗、二抗，顯色，蘇木素復染，中性樹膠封固。

每批染色設定陰性內對照(用PBS代替一抗)，用已知的陽性切片作為陽性對照。均由兩位病理科醫師按照以下標準進行判斷，如有分歧，則協商一致。

VEGF、HIF-1α結果判定：VEGF蛋白陽性表達為細胞漿顯示棕黃色顆粒；HIF-1α 蛋白陽性表達為在胞核和(或)胞質出現棕黃色顆粒。每張切片隨機觀察5個高倍視野(×200)，根據染色強度和陽性細胞比例進行評分。染色強度：無著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細胞比例：<25%為1分，25%～49%為2分，50%～75%為3分，>75%為4分。兩者得分相乘，0～1分為(-)，2～4分為(+)，5～8分為()，9～12分為()，見圖2～5。

圖1 男，58歲，右肺上葉后段腺癌。a) Perfusion偽彩圖，Perfusion值為24.81 mL/(min·100mL)； b) PEI偽彩圖，PEI值為8.96 HU； c) TTP偽彩圖，TTP值為10.36 s； d) BV偽彩圖，BV值為2.64 mL/100g； e) CT平掃縱膈窗，顯示右肺上葉后段結節，大小約2.7 cm×2.4 cm，見短毛刺，鄰近胸膜牽拉增厚； f) VEGF染色圖(×200)，VEGF染色結果為(-)。

圖2 男，54歲，左肺下葉背段腺癌。a) CT平掃縱膈窗，顯示左肺下葉背段分葉狀結節，大小約2.2 cm×1.1 cm； b) Perfusion偽彩圖，Perfusion值為55.54 mL/(min·100mL)； c) VEGF染色圖(×200)，VEGF染色結果為(+)。 圖3 女，56歲，左肺下葉前基底段腺癌。a) CT平掃縱膈窗，顯示左肺下葉前基底段略呈分葉狀結節，大小約2.2 cm×1.6 cm； b) Perfusion偽彩圖，Perfusion值為68.83 mL/(min·100mL)； c) VEGF染色圖(×200)，VEGF染色結果為()。

Ki-67結果判定：Ki-67蛋白陽性表達為胞核出現棕黃色顆粒，每張切片隨機觀察5 個高倍視野(×200)，根據陽性細胞比例進行評分：(-)，陽性細胞數<25% ；(+) ，陽性細胞數25%～49% ；()，陽性細胞數50%～75%；()，陽性細胞數>75%。

圖4 男，56歲，右肺上葉后段腺癌。a) CT平掃縱膈窗，顯示右肺上葉后段形態不規則腫塊影，大小約3.3 cm×2.4 cm； b) Perfusion偽彩圖，Perfusion值為96.67 mL/(min·100mL)； c) VEGF染色圖(×200)，VEGF染色結果為()。 圖5 女，77歲，右肺下葉外基底段鱗癌。a) CT平掃縱膈窗，顯示右肺下葉外基底段不規則腫塊，大小約3.3 cm×4.7 cm； b) Perfusion偽彩圖，Perfusion值為72.55 mL/(min·100mL)； c) VEGF染色圖(×200)，VEGF染色結果為()。

表1 非小細胞肺癌CT灌注參數與VEGF、HIF-1α、Ki-67的相關分析

4.統計學方法

結 果

1.非小細胞肺癌CT灌注參數及免疫組化結果

24例NSCLC中，Perfusion平均值為(65.51±23.15)mL/(min·100mL)，BV平均值為(9.87±9.55)mL/100g，PEI平均值為(25.54±20.08)HU，TTP平均值為(11.91±6.45)s。

HIF-1α：陰性(-)12例，弱陽性(+)11例，中度陽性()1例，強陽性()0 例，總陽性率50%。

Ki-67：陰性(-)9例，弱陽性(+)3 例，中度陽性()8例，強陽性()4例，總陽性率62.5%。

2.非小細胞肺癌 CT灌注參數與VEGF、HIF-1α、Ki-67表達的相關性

Perfusion、 BV與VEGF 表達呈正相關，且Perfusion與VEGF相關性較高(r=0.698，P<0.001；r=0.474，P=0.019)。PEI、TTP與VEGF的表達沒有相關性(P均>0.05)。

Perfusion與HIF-1α表達呈正相關(r=0.446，P=0.029)。BV、PEI、TTP與HIF-1α的表達沒有相關性(P均>0.05)。

Perfusion、BV、PEI、TTP與Ki-67的的表達沒有相關性(P均>0.05，表1)。

表2 肺腺癌中CT灌注參數與VEGF、HIF-1α、Ki-67的相關分析

表3 肺鱗癌中CT灌注參數與VEGF、HIF-1α、Ki-67的相關分析

3.肺腺癌 CT灌注參數與VEGF、HIF-1α、Ki-67表達的相關性

肺腺癌中Perfusion與VEGF表達呈正相關(r=0.624，P=0.007，圖2～4)，BV、PEI、TTP與VEGF的表達沒有相關性(P均>0.05)。肺腺癌 CTPI參數與HIF-1α、Ki-67的表達均沒有相關性(P均>0.05，表2)。

4.肺鱗癌 CTPI參數與VEGF、HIF-1α、Ki-67表達的相關性

肺鱗癌中Perfusion與VEGF表達呈正相關(r=0.896，P=0.006)，BV、PEI、TTP與VEGF的表達沒有相關性(P均>0.05)。肺鱗癌 CTPI參數與HIF-1α、Ki-67的表達均沒有相關性(P均>0.05，表3)。

討 論

肺癌是最常見的癌癥死亡原因，每年有1800萬人被診斷患有肺癌，有1600萬人因肺癌而死亡[2]。臨床上很多NSCLC患者發現時常為中晚期，此時通過對患者進行基因檢測，根據結果采取靶向藥物治療是有效措施[5]，近年來部分分子靶向藥物治療已在臨床上得到廣泛的應用，如針對EGFR的吉非替尼，針對VEGF的PTK787藥物[6]。分子靶向藥物必須確定腫瘤細胞中存在過度表達才有效。通過探討CT灌注掃描是否能無創性提供分子指標在肺癌中的表達情況，可以為臨床診斷、治療提供個性化方案。

VEGF是促進血管生成的最具特異性和關鍵性的調節因子之一，在腫瘤血管形成過程中起著重要作用[7]，而CT灌注可以無創性提供腫瘤組織中微循環內血流動力學變化的信息[8]。本研究24例NSCLC證明Perfusion、 BV與NSCLC組織中的VEGF表達呈正相關(r=0.698、0.474)，差異有統計學意義，與Ling等[9]學者研究相符。接著進一步對肺腺癌、鱗癌CTPI參數與VEGF表達進行相關性分析，提示Perfusion與肺腺癌、鱗癌中VEGF表達呈正相關(r=0.624、0.896)，BV與腺癌、鱗癌中VEGF表達沒有顯著相關性。因此，筆者認為Perfusion值更能反映腺癌、鱗癌中的血管新生情況，在對肺腺癌、鱗癌患者進行抗血管分子靶向治療過程中，可能可以利用Perfusion值預測患者對分子靶向藥物的敏感性，指導后續治療方案。

腫瘤細胞無限增殖導致氧消耗增加，與周圍正常組織相比，大部分實體腫瘤內部都發生缺氧。缺氧情況下，HIF-1α表達增多，NSCLC中腫瘤缺氧通常與預后不良相關[10]。本研究顯示，NSCLC組織中Perfusion與HIF-1α表達呈顯著正相關，余CTPI參數值與HIF-1α表達沒有相關性，與劉琴等[11]研究結果一致。肺癌組織細胞代謝旺盛，存在供氧和耗氧之間的不平衡，缺氧情況下，HIF-1α可轉導至細胞核中，與下游基因VEGF結合，促進新生血管形成[12]，使得腫瘤組織中的灌注量增加。然而，腫瘤組織內缺氧面積過大，氧氣供應不足，壞死面積增大，腫瘤組織中的灌注量也會隨之減少。本研究中，Perfusion與HIF-1α表達呈正相關，猜測可能與HIF-1α促血流量增加作用更為明顯，且本研究中入組的肺癌患者發生壞死比例較少有關。然而進一步的亞組分析中表明，肺腺癌、鱗癌中Perfusion與HIF-1α表達沒有顯著相關性。腫瘤組織中氧消耗增加，促進灌注量增加以適應腫瘤缺氧微環境，故Perfusion與HIF-1α表達呈正相關，但在腺癌、鱗癌中并無顯著相關性，可能與本研究中樣本量過少、腫瘤組織的異質性有關。根據本研究結果，筆者認為Perfusion值在一定程度上可提供腫瘤組織內的缺氧情況。

Ki-67的表達與腫瘤細胞增殖和生長密切相關，其主要是在細胞增殖期表達，在靜止期不存在，臨床上常用其作為腫瘤增殖標記物[13]。Ki-67在腫瘤組織中的表達可用來評估腫瘤患者的預后并發揮一定的預測作用，已有研究顯示通過顯微注射抗體或使用反義寡核苷酸阻斷Ki-67表達從而阻斷腫瘤細胞增殖[14]，故Ki-67表達可能識別并預測對特定療法產生反應的患者亞群，是一種潛在的腫瘤治療靶點。本研究顯示NSSLC中Ki-67表達與Perfusion值呈無顯著相關性。肺癌中Ki-67與CTPI參數的相關性研究國內外鮮見報道，目前只找到如下兩篇：Sauter等[15]發現肺癌中Ki-67與BF值的呈負相關(r=-0.127，P>0.05)，與本研究結果一致。然而，國內劉佩等[16]采用雙入口灌注技術探討灌注參數與Ki-67陽性表達率的相關性分析，得出BF與Ki-67陽性表達率呈正相關(r=0.686，P<0.01)。Ki-67表達越多，腫瘤細胞增殖速度越快，Perfusion值表示單位時間內、組織質量的血流量，故腫瘤細胞增殖速度與Perfusion是否存在相關性，是呈正相關還是負相關仍需進一步探討。

本研究局限性：一是總體樣本量較少，且沒有HIF-1α表達強陽性的病例；二是未對NSCLC的分化程度與CT灌注參數的相關性進行進一步研究；三是CT灌注成像具有一定的輻射劑量。因此，在接下來的研究過程中，需增加更多的病例，進行更詳細的指標分類完善研究，且關于NSCLC中CT低劑量灌注掃描的可行性亦值得進一步的探討。

綜上所述，CT灌注參數可以評價肺癌中血管新生速度，且在對肺腺癌、鱗癌患者進行抗血管分子靶向治療過程中，可以利用CT灌注掃描預測患者對分子靶向藥物的敏感性，指導后續治療方案。