艾地苯醌對血管性癡呆大鼠海馬突觸再生和可塑性的影響

錢旭東 王東 徐倩倩 李國蕓 王紅梅 張曉璇 馬征

(承德醫學院附屬醫院 1神經內科，河北 承德 067000；2呼吸內科)

我國血管性癡呆(VD)的發病率不斷上升，目前僅次于阿爾茨海默病(AD)，癡呆患者中大約有1/5是VD患者〔1〕。突觸是神經信息傳遞與處理過程的中心環節，研究報道稱神經突觸的超微結構與認知功能密切相關，表明突觸的數量及功能狀態對認知功能有決定性作用〔2，3〕。對艾地苯醌在VD方面的研究發現，其能促進 VD 大鼠海馬組織腦源性神經營養因子(BDNF)的表達，而 BDNF 與其受體共同作用可促進突觸再生，提高突觸可塑性，從而改善 VD 大鼠癡呆狀況〔4〕。為進一步明確艾地苯醌對 VD 大鼠海馬區突觸的影響，本研究從突觸相關蛋白的表達和突觸超微結構的角度進行研究。

1 資料與方法

1.1實驗動物 實驗動物 SPF級，體重250～300 g，7周齡，健康SD清潔級雄性大鼠40只，動物使用許可證號：SCXK(冀)2008-1-003，動物合格證編號：1404010，來源河北醫科大學實驗動物中心。在濕度50%～70%、室溫20℃～25℃中飼養，每籠5 只，喂養普通顆粒型大鼠飼料，正式實驗之前，適應性飼養1 w。

1.2試劑與儀器 小鼠抗大鼠微管相關蛋白(MAP)-2抗體、小鼠抗大鼠突觸素(SYP)抗體及小鼠抗大鼠突觸后密度蛋白(PSD)-95抗體均購自武漢博士德生物工程有限公司，山羊抗小鼠〔辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗〕購自上海Abcam公司，Western印跡ECL化學發光檢測試劑盒購自美國Bio-Rad公司，ZS-001 Morris水迷宮購自北京眾實迪創科技發展有限公司，TH4-200倒置顯微系統購自日本OLYMPUS。

1.3動物建模與分組 適應性喂養1 w后，按照隨機數字表將大鼠分為手術組(n=28)及假手術組(n=12)。手術組采用改良雙血管阻斷(2-VO)法建立大鼠 VD 模型，具體方法為：大鼠采用異氟烷吸入麻醉后先分離右側頸總動脈并兩端結扎，從結扎中心剪斷頸總動脈，分層縫合并以青霉素 40萬U/只局部注射預防感染，1 w后以同樣方法處理左側頸總動脈。假手術組不結扎及剪斷頸總動脈，其余操作步驟同手術組。模型建立6 w后，運用Morris 水迷宮方法挑選28只成功建模的大鼠。(逃避潛伏期各時段成績均值-平均對照組逃避時間)/逃避潛伏期該組大鼠均值≥0.2作為模型成功的辨別條件。將28只成模大鼠平均分為兩組，分別是艾地苯醌組、模型組，兩組給藥采取腹腔注射，10 mg/kg，持續給藥4 w，模型組及假手術組注入等量的生理鹽水。

1.4大鼠學習記憶能力檢測 給藥30 d后，對每組大鼠進行Morris 水迷宮實驗，持續6 d，前5 d用于定位航行，空間探索實驗利用最后1 d。水溫穩定在22℃左右，水深約0.35 m，用攝像頭跟蹤老鼠的位置。通過水迷宮分析系統對采集的圖像及視頻進行數據分析。定位航行測試：進水點是以每個象限的中點為標記，統計2 min內大鼠發現平臺的位置，停留在平臺上時間超過2 s是避開潛伏期。1天4次，算出平均值。空間探索測試：撤除原平臺，將大鼠隨機選一進水點放入水中，統計2 min內大鼠穿越原平臺的次數和停留時間。

1.5免疫組織化學檢測 取各組大鼠腦組織切片通過二甲苯對石蠟切片進行兩次脫蠟過程，使用酒精梯度清洗脫蠟后的組織：二甲苯孵化5 min，棄二甲苯，重新添加二甲苯再次孵化5 min，無水乙醇、無水乙醇Ⅱ洗滌、95%乙醇依次洗滌3 min，80%乙醇 洗滌3 min，而后磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次，每次3 min；將切片放至含有0.01 mmol/L檸檬酸緩沖液中，對切片進行恢復，并放入微波爐，加熱15 min，冷卻至室溫；將石蠟切片取出，放置在3% H2O2中(13±2)min，然后使用PBS洗滌3次；按照1∶500的比例加入NMDAR抗體，對石蠟組織切片進行室溫孵育1 h或者4℃孵育過夜，之后用PBS沖洗3次，每次3 min；按照1∶1 000的比例加入HRP二抗，對石蠟組織切片進行室溫孵育40 min，之后用PBS沖洗3次，每次3 min；加入DAB試劑盒中的顯色劑，室溫孵育5～10 min，然后清水沖洗；再進行蘇木素復染室溫孵育3～5 min，清水沖洗；對染色后的切片進行梯度酒精水化處理，采用樹脂進行封膠固定后觀察。對組織切片中的NMDAR采取上述相同的操作方法進行免疫組織化學染色觀察。

1.6突觸顯微結構觀察 每組選擇 3 只大鼠，使用10%水合氯醛(0.35 g/kg)腹腔注射麻醉后進行斷頭處死，此時對腦組織進行快速剝離，順著視交叉前端切一個冠狀面，選取3 塊、大小約為1 mm3的大鼠左邊腦部CA1 區海馬組織，按照固定-漂洗-脫水-滲透-包埋順序操作后，制作60～80 nm超薄切片。采用鈾鉛進行雙染色，并經充分瀝水過夜后，利用透射電鏡研究突觸情況。

1.7統計學方法 采用SPSS21.0軟件進行t檢驗及方差分析。

2 結 果

2.13組學習記憶能力比較 連續給藥1 w后，與假手術組比較，模型組逃避潛伏時間明顯增高，而穿越平臺次數明顯減少(均P<0.05)；與模型組比較，艾地苯醌組逃避潛伏時間明顯減少，而穿越平臺次數明顯增高(均P<0.05)。見表1。

表1 3組學習記憶能力比較

2.23組海馬相關突觸蛋白的表達 3組MAP-2、SYP、PSD-95表達水平比較：艾地苯醌組>假手術組>模型組(均P<0.05)。見表2，圖1、圖2。

表2 3組海馬突觸蛋白表達比較

圖1 各組海馬MAP-2表達(DAB，×400)

圖2 各組海馬突觸相關蛋白表達(DAB，×400)

2.33組突觸超微結構的變化 假手術組突觸結構完整，突觸間隙清晰可見，突觸前后膜間吻合良好，突觸后膜可見均勻增厚，突觸曲面弧度規整，突觸小泡豐富，有結構完整的線粒體；模型組無突觸間隙，前后突觸膜界限難以區分，弧度不整齊，具有較少的突觸小泡，線粒體出現腫大或消失；艾地苯醌可見清晰突觸間隙、均勻增厚的突觸后膜，突觸結構大體完整，有較多的突觸小泡和完整、豐富的線粒體結構。見圖3。

圖3 各組突觸超微結構(×3 000)

3 討 論

VD是最常見的認知功能障礙病因之一，病變的腦血管引起全腦或局部供血、供氧不足，從而導致參與認知記憶等腦部特定神經組織受損可能與其發病的機制相關〔5〕。中樞神經系統對缺血缺氧有高度的敏感性，特別是小腦、海馬、大腦皮質(第三層)等部位〔6〕。腦缺血受損會引發級聯反應，比如氧化應激、細胞凋亡、炎癥反應、腦梗死周圍去極化、興奮性氨基酸毒性及能量衰竭等環節會使突觸傳遞和神經遞質調控受到影響，促使神經元突變受損，進而使學習記憶功能出現障礙〔7〕。大鼠和人類一樣，具有完整的Willis環，因此本研究采用2-VO法建立大鼠VD模型，而雙側頸總動脈阻斷后可導致大鼠海馬慢性供血不足。海馬CA1區神經元對缺血、缺氧損害極其敏感，頸總動脈阻斷導致的缺血缺氧性病變勢必導致神經元凋亡及突觸的變性和丟失，使突觸數量下降，可塑性降低，突觸相關蛋白表達發生改變，并進一步影響突觸的結構與功能〔8，9〕。研究表明，突觸相關蛋白可調控突觸的生長、發育、成熟，并與突觸可塑性密切相關，當其表達發生變化后會導致個體產生交流缺陷、認知功能受損與感覺、焦慮等神經精神癥狀及社會活動缺陷等，因此突觸相關蛋白的表達是突觸數量及功能狀態的標志，能夠從微觀層面反映突觸的病理生理變化〔10〕。

本研究發現，艾地苯醌能明顯改善VD大鼠的學習記憶能力。免疫組化檢測則進一步證實艾地苯醌能明顯促進突觸相關蛋白SYP、MAP-2、PSD-95的表達。SYP是一種突觸前囊泡特定蛋白，由313個氨基酸組成，分子量38 kD，對突觸形成和突觸功能的維持意義重大，是突觸重建的重要標志〔10〕。SYP可作為突觸結構的標志物，在神經外科手術中常用來標記突觸終末，避免神經損傷。作為樹突生長神經元標志蛋白的MAP-2主要在突觸后致密區、樹突棘、樹突、神經元胞體中表達，與樹突棘的功能及形態和突觸可塑性緊密關聯，有調控突觸可塑性，促進神經元突起成形等作用，與癲癇等疾病密切相關〔11〕。PSD-95是一種由724個氨基酸構成的突觸后蛋白，與突觸的可塑性、學習記憶等相關，其變異可導致個體智能障礙〔12〕。PSD-95不僅參與突觸信號的修飾，而且對樹突棘從生長-發育-分支-成熟的過程中都扮演著主要的作用。神經元PSD-95的表達增多和突觸興奮性增強相關，而AD及輕度認知障礙(MCI)患者的神經元PSD-95表達則明顯下降〔13～16〕。艾地苯醌MAP-2表達水平上升提示艾地苯醌對樹突成形和新突觸形成有促進作用，改善突觸可塑性，增強大鼠的學習和記憶能力；另一方面，艾地苯醌大鼠SYP與PSD-95也明顯升高，說明艾地苯醌能夠保存現有突觸，并促進了突觸重建與再生，從而保護了缺血缺氧損傷的神經組織。PSD-95與MAP-2表達水平提升說明生成的神經元樹突及增多和成熟的樹突棘創造了突觸重建的條件。電鏡觀察也進一步表明大鼠經艾地苯醌治療后有正常突觸結構，豐富的突觸囊泡，突觸的尺寸變大，這些變化為神經信息的有效傳遞和治療提供了物質基礎。模型組無突觸間隙，前后突觸膜界限難以區分，無正常曲面，弧度不整齊，有較少的突觸小泡，線粒體出現腫大或消失；PSD-95、MAP-2、SYP比假手術組和艾地苯醌明顯降低，提示學習記憶能力下降與突觸損害、萎縮或凋亡緊密相關。

綜上，艾地苯醌可能對強突觸相關蛋白SYP、PSD-95、MAP-2的表達以上調的方式，改善學習記憶功能。動物實驗表明艾地苯醌還能促使突觸再生，確保了突觸的生理結構及功能正常，為神經信息有序高效的處理創造了物質前提。