聲表面波氣相色譜儀快速定性分析姜黃揮發油*

柳小莉 朱宏偉 王 芳 張小飛 黃小英 李慧婷 陸艷艷 孫 林 楊 明 何世堂

(1 成都中醫藥大學 成都 611137)

(2 中國科學院聲學研究所 北京 100190)

(3 江西中醫藥大學 南昌 330004)

(4 陜西中醫藥大學 咸陽 712000)

0 引言

姜黃揮發油是從姜黃(Curcuma Longa L.)根莖中提取出來的一類揮發性油狀混合物，由芳香化合物組成，具有抑菌、抗炎、抗腫瘤等作用[1]，應用范圍廣泛，涉及食品、醫藥、化妝品等領域，安全無毒的特點使姜黃揮發油受到越來越多的關注。姜黃揮發油藥理作用與其化學成分組成和含量密切相關，化學成分差異受姜黃品種、生長環境、氣候條件等因素影響，但主要成分有芳姜黃酮、姜黃酮、姜黃烯、沒藥烯、倍半水芹烯及桉油精等[2-3]。目前姜黃揮發油中化學成分檢測方法以氣相色譜-質譜儀(Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS)為主，需要對樣品進行前處理，檢測時間長，且GC-MS 儀器昂貴，需要專業人員操作，在檢測時間與工作效率上有一定的局限性，因此在探索能對姜黃揮發油化學成分快速簡便的檢測技術中，經過多方面的考量與對比，聲表面波氣相色譜儀(Surface acoustic wave gas chromatography，GC-SAW)成為本文在檢測技術上的考察對象。

GC-SAW 是基于聲表面波傳感器與氣相色譜分離聯用的有機氣體分析儀，利用氣相色譜柱將混合樣品分離成純組分，由聲表面波傳感器對其進行定量檢測。其中聲表面波傳感器由聲表面波諧振器和半導體制冷器組成。聲表面波諧振器加上電路組成高頻率穩定度振蕩器，可以保證低濃度檢測時有足夠的信噪比。半導體制冷器保證檢測時冷卻檢測器，便于被測組分吸附在檢測器表面。檢測結束后加熱檢測器，將吸附在傳感器表面的組分清除[4]。聲表面波傳感器是利用氣體吸附在器件表面引起聲波傳播速度的變化，從而引起頻率的變化實現定量檢測。聲表面波傳感器體積小，與毛細管色譜柱內徑尺寸相當，由色譜柱聚集噴出的待測組分冷凝吸附在檢測器表面，最大化低濃度瞬時氣體的響應，進一步提升靈敏度。理論計算結果與實際測試結果顯示，聲表面波傳感器的檢測下限最低可至10-13g 級別[5]。聲表面波傳感器為非選擇性傳感器，對各種有機氣體成分都有響應，同時由于聲表面波傳感器是利用氣體吸附在其表面而引起頻率的變化，因此其靈敏度與氣體的揮發性成反比，相同溫度條件下，揮發性差的組分更容易冷凝吸附，同時更難從檢測器表面脫附，因而對其具有更高的靈敏度。GC-SAW 使用金屬毛細管柱，直接柱上加熱，升溫速率可達10～20°C/s，升溫速率快，且柱長較短，聲表面波檢測器響應速度快，因此單個樣品的檢測時間大大縮短，可實現20 s 內所有組分全部出峰。

綜上所述，GC-SAW 具有檢測靈敏度高、色譜柱升溫速度快、儀器體積小等特點，可實現痕量氣體的廣譜(揮發和半揮發性有機物)、快速(＜5 min)、高靈敏度(10-9～10-12級)分析[6-7]，在公共安全、水質污染監測等方面體現了較好的應用優勢[5]。GC-SAW 實際檢測過程分為兩個階段：(1)采樣階段，氣體被富集在樣品預濃縮微捕集阱中；(2)分析階段，被富集的樣品由載氣帶入氣相色譜柱中，經由色譜柱實現不同組分在時間上的分離，以此對不同組分定性，分離出的組分依次冷凝在SAW 檢測器表面，再根據頻率變化量的檢測實現對被測組分的定量分析[8]。GC-SAW 儀器(圖1)已經在2，4，6-三硝基甲苯(TNT)現場分析與制毒化學品羥亞胺殘留物快速檢測方面有較好應用，但在中藥精油方面的檢測還沒有涉及。

圖1 GC-SAW 設備圖Fig.1 GC-SAW equipment diagram

本文使用中國科學院聲學研究所研發的GCSAW 儀對姜黃揮發油中的化學成分進行檢測，以姜黃揮發油GC-MS 與GC-SAW 檢測結果進行比較對照，分析GC-SAW 快速檢測姜黃精油的潛在應用，為姜黃揮發油鑒定提供一種新的、更快捷的檢測技術，為中藥精油快速分析提供檢測技術基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗耗材與設備

實驗耗材如下：姜黃藥材(成都慧鋤科技有限公司，批號JF1/20190228)；無水硫酸鈉(分析純，西隴科學股份有限公司，批號1804081)；無水乙醇(分析純，西隴科學股份有限公司，批號19060102)；正己烷(≥99.5%，TEDIA，18040182)；正庚烷(≥99.5%，阿拉丁，A1701100)；正辛烷(≥99.5%，北京銳志漢興科技有限公司，90507)；正壬烷(≥99.5%，北京銳志漢興科技有限公司，90513)；正癸烷(≥99.5%，北京銳志漢興科技有限公司，80819)；正十一烷(≥99.5%，北京銳志漢興科技有限公司，20328)；正十二烷(≥99.5%，北京銳志漢興科技有限公司，00921)；正十三烷(≥99.5%，北京銳志漢興科技有限公司，20328)；正十四烷(≥99.5%，北京銳志漢興科技有限公司，00611)；正十五烷(≥99.5%，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司，FHN01-QDKN)；正十六烷(≥99.5%，北京銳志漢興科技有限公司，80428)；正十七烷(≥99.5%，北京百靈威科技有限公司，L580O16)；正十八烷(≥99.5%，北京銳志漢興科技有限公司，10428)；甲醇(≥99.5%，TEDIA，17070654)。反式石竹烯(≥90%，江西佰草源生物科技有限公司，BCY-001550)。

實驗設備如下：GC-MS(Agilent 7890A/5975C，美國安捷倫科技有限公司)；GC-SAW (中國科學院聲學研究所自研設備)。

1.2 實驗方法

1.2.1 姜黃揮發油獲取方法

采用水蒸氣蒸餾法提取姜黃揮發油，收集揮發油用無水硫酸鈉脫水后，裝入棕色玻璃瓶放置于4°C避光環境下保存，待分析。

1.2.2 GC-MS檢測條件

制樣方法如下：取50 μL姜黃揮發油，加入無水乙醇定容至10 mL 容量瓶中，溶液使用0.45 μm 有機濾膜過濾，取續濾液于進樣瓶中，即得。

檢測條件如下：安捷倫HP-5MS 柱(0.25 mm×30 m，0.25 μm)；進樣口溫度250°C；進樣量：1 μL；分流比：40:1；流速：1 mL/min；升溫程序：起始溫度60°C 保持，以5°C/min 升溫至150°C，以2°C/min升溫至200°C。質譜采用EI 離子源，離子源溫度230°C，電離能量70 eV，掃描范圍全掃描，四級桿溫度150°C，溶劑延遲時間3 min，質譜檢索庫為NIST14.L。

1.2.3 GC-SAW檢測條件

C6-C18 正構烷烴溶液制樣方法如下：分別移取正己烷3 mL、正庚烷1.5 mL、正辛烷0.3 mL、正壬烷30 μL，正十一烷10 μL、正十二烷6 μL、正十三烷5 μL、正十四烷5 μL、正十五烷5 μL、正十六烷5 μL、正十七烷5 μL、正十八烷5 μL至100 ml容量瓶中，用甲醇定容，混勻，即得C6-C18 正構烷烴溶液。

姜黃揮發油制樣方法如下：(1)移液槍移取100 μL 姜黃揮發油樣品加入到40 mL 頂空瓶中，平衡5 min 后，頂空進樣測試；(2)移液槍移取50 μL姜黃揮發油，加入到裝有少量甲醇的5 mL 容量瓶中，甲醇定容、搖勻，得到稀釋100 倍的姜黃揮發油溶液I；移液槍分別移取62.5 μL 和500 μL 溶液I 至5 mL容量瓶中，甲醇定容、搖勻，分別得到稀釋8000倍和1000 倍的姜黃揮發油溶液II 和溶液III；溶液II 和溶液III 使用0.45 μm 有機濾膜過濾，取續濾液于進樣瓶中，微量進樣器分別取0.1 μL進樣測試。

檢測方法如下：色譜柱DB-5(1 m×0.25 mm×0.25 μm)，初始溫度45°C，按6°C/s 程序升溫至160°C，柱流量3 mL/min；進樣口溫度200°C；六通閥溫度160°C；預濃縮管烘烤溫度250°C，采樣流量30 mL/min；檢測器60°C，檢測器烘烤溫度150°C；載氣N2；泵吸時間5 s；分析時間20 s。使用GC-SAW 測試時，先使用C6-C18 正構烷烴標準溶液對儀器進行保留指數校準。

1.2.4 GC-SAW 姜黃揮發油中反式石竹烯定量分析方法

配制濃度分別為0.001624 mg/mL、0.004059 mg/mL和0.01624 mg/mL的反式石竹烯標準溶液，按照1.2.3節的檢測方法，以峰面積對濃度繪制標準曲線，得到線性回歸方程，以外標法進行定量。各濃度反式石竹烯分別測定5 次，計算相對標準偏差(Relative standard deviation，RSD)，考察儀器精密度；連續測定5 天，計算RSD，考察日間重復性。根據線性回歸方程和姜黃揮發油樣品中反式石竹烯的峰面積，計算揮發油中反式石竹烯的含量。

2 結果與分析

2.1 姜黃揮發油GC-MS檢測結果

GC-MS 共檢出22 種化學成分，其中匹配度在80%以上有12種成分，為總成分的92.1%，姜黃揮發油GC-MS 總離子流圖見圖2，12 種成分信息如表1所示。

表1 GC-MS 結果中12 種成分理化性質Table 1 Physicochemical properties of 12 components in GC-MS results

圖2 姜黃揮發油GC-MS 總離子流圖Fig.2 The total ion chromatogram of turmeric volatile oil of GC-MS

此外，表2中列出了文獻[18-19]中姜黃揮發油含量較少的揮發性成分的相關信息。

表2 文獻中姜黃揮發油中含量較少的揮發性成分Table 2 Less volatile components of turmeric volatile oil in literature

2.2 姜黃揮發油GC-SAW檢測結果

2.2.1 正構烷烴對儀器的校準

圖3給出了GC-SAW測試C6-C18正構烷烴溶液的色譜圖，圖3(a)中橫坐標以保留時間顯示，圖3(b)橫坐標以保留指數顯示。正構烷烴溶液中含有從正己烷(C6)到正十八烷(C18)共計13 種組分，因此色譜圖中對應的檢出有13個色譜峰，所有峰在20 s 內全部檢出。在對各個峰進行強制校準后，每個組分峰的保留指數與其碳數相關，即正己烷的保留指數為600，正庚烷的保留指數為700，依此類推。檢測未知樣品時，各組分峰的保留指數根據正構烷烴校準結果和各組分峰的保留時間由儀器軟件直接給出，根據保留指數對各個峰進行定性。根據氣相色譜相關理論，在相同色譜條件下，同一物質的保留指數不隨設備的改變、測試人員等外部條件的變化而變化，因此對未知物質的定性具有相對較好的穩定性和可靠性。

圖3 正構烷烴頂空測試色譜圖Fig.3 Headspace-tested chromatogram of n-Alkanes

2.2.2 姜黃揮發油快速頂空測試

GC-SAW頂空測試姜黃揮發油的色譜圖如圖4所示，橫坐標以保留時間顯示，所有組分在20 s內完成出峰。

圖4 姜黃精油GC-SAW 頂空檢測色譜圖Fig.4 Headspace-tested chromatogram of turmeric essential oil in GC-SAW

根據GC-MS 檢測結果以及查閱到的化學成分保留指數信息，對GC-SAW儀測得的各個色譜峰進行物質歸屬，并對各物質含量按照歸一化法進行計算，結果見表3。

表3 GC-SAW 姜黃揮發油頂空測試結果(n=3)Table 3 Headspace test results of GC-SAW of turmeric volatile oil (n=3)

在GC-SAW 姜黃揮發油化學成分與百分含量結果中，共檢測出14 種物質；其中有11 種物質明確了保留指數下對應的化學成分，它們分別為：保留指數925 處的峰歸屬于α-蒎烯(0.99%)，保留指數990 處的峰歸屬于α-水芹烯(3.13%)，保留指數1032 處的峰歸屬于桉樹醇(9.90%)，1104 處的峰歸屬于α-異松油烯(28.63%)，1194 處的峰歸屬于α-松油醇(1.77%)，1419 處的峰歸屬于反式石竹烯(6.56%)，1464 處的峰歸屬于(E)-β-法呢烯(1.29%)，1497 處的峰歸屬于α-姜黃烯和α-姜烯(百分含量合計30.04%)，1532 處的峰歸屬于β-倍半水芹烯(0.62%)，1589 處的峰歸屬于莪術醇(0.88%)，1674處的峰歸屬于芳姜黃酮、α-姜黃酮和β-姜黃酮(百分含量合計13.65%)。一方面由于保留指數747、1069 和1379 三個峰的相對含量較低，GC-MS 沒有該峰的檢出；另一方面姜黃揮發油檢測相關文獻中沒有保留指數接近的組分，因此無法確定這三組峰對應的化學組分。

2.2.3 姜黃揮發油液體進樣測試

(1)姜黃揮發油液體進樣測試

取0.1 μL 姜黃揮發油溶液II(稀釋8000 倍)進樣測試，檢測色譜圖如圖5所示。以峰面積歸一化法計算各組分的相對含量，其中峰面積最大的姜黃酮的相對含量為95.55% (峰面積為261091 Hz)，其次莪術醇的相對含量為1.74% (峰面積為4752 Hz)，姜烯的含量為1.34% (峰面積為3656 Hz)，這3 種組分的總含量之和達到98.63%，其他組分的相對含量均在1.0%以下。GC-MS 結果顯示，姜黃酮和姜烯的總含量達到80.37%。盡管兩種方式檢測結果存在一定差異，但可以確定姜黃酮和姜烯是姜黃精油的主要成分。GC-SAW的檢測結果偏高，是由SAW檢測器的靈敏度特性引起的，即靈敏度與樣品的揮發性成反比，揮發性差、沸點高的組分具有更高的靈敏度。

圖5 姜黃精油以甲醇稀釋8000 倍時液體進樣測試色譜圖Fig.5 Liquid injection test chromatogram of turmeric essential oil diluted 8000 times with methanol

(2)姜黃揮發油中反式石竹烯的定量分析

GC-MS 和GC-SAW 檢測結果顯示，姜黃精油中保留指數1419 處的峰來自于反式石竹烯。通過液體進樣測試不同濃度的反式石竹烯繪制外標法標準曲線，以實現對姜黃揮發油中反式石竹烯的準確定量分析。

檢出限和標準曲線 配制濃度分別為0.001624 mg/mL、0.004059 mg/mL 和0.01624 mg/mL 的反式石竹烯標準溶液，在本方法選擇的儀器條件下使用GC-SAW進行檢測，以峰面積對濃度繪制標準曲線，得到線性回歸方程為y=171709x+437.1，相關系數R= 0.9976，在0.001624～0.01624 mg/mL 范圍內具有較好的線性關系。0.001624 mg/mL 反式石竹烯的平均響應值為633 Hz，按照本條件下基線噪聲(圖6)的3倍對應的標準溶液的濃度計算，最低檢出限為1.69×10-4mg/mL，絕對質量為16.9 pg。

圖6 GC-SAW 基線噪聲Fig.6 Baseline noise of GC-SAW

精密度和重復性 0.001624 mg/mL、0.004059 mg/mL 和0.01624 mg/mL 的反式石竹烯標準溶液分別連續測定5 次，響應值的RSD 分別為3.60%、1.99%和1.47%，見表4，結果表明方法的精密度良好。低、中和高濃度的反式石竹烯標準溶液連續測試5 天，每次各濃度均測定5 次，計算日間重復性，測試結果見表5，RSD值分別為5.17%、3.07%和4.72%，說明方法重復性較好。

表5 低、中和高濃度的反式石竹烯標準溶液重復性測試(n=5)Table 5 Repeatability test of transcaryophyllene standard solution (n=5)

樣品中反式石竹烯的含量 在當前儀器條件下，進樣測試姜黃揮發油溶液III(稀釋1000 倍)，檢出反式石竹烯的響應值為1373 Hz (n= 3)，根據線性回歸方程計算其溶液III 中反式石竹烯的濃度為0.005451 mg/mL，即原揮發油樣品中的濃度為5.451 mg/mL。在測試溶液III 時，由于姜黃酮濃度太高，導致檢測器停振，因此在進行定量檢測時，待檢出反式石竹烯的色譜峰后，立即斷開檢測器，以避免檢測器因多次停振而損壞。

2.3 GC-MS與GC-SAW結果對比與討論

GC-MS與GC-SAW共同檢測出了姜黃揮發油中10種化學成分，結果見表6。

表6 GC-MS 與GC-SAW 共有成分信息Table 6 Common component information of GC-MS and GC-SAW

在GC-MS 與GC-SAW 檢測結果中，10 種成分總的相對百分含量分別為90.82%、90.69%和97.53%，說明這10 種成分在姜黃精油中有充分代表性。同樣以液體進樣的方式進樣測試，在GCMS 定量分析結果中，姜黃酮(包括芳姜黃酮、α-姜黃酮和β-姜黃酮)和姜烯(α-姜黃烯和姜烯)的百分含量之和達到80.37%，GC-SAW定量分析結果中其百分含量之和則達到96.89%，說明這幾種組分為姜黃精油的主要成分。GC-SAW 的檢測結果偏高，由SAW檢測器的靈敏度特性引起，即靈敏度與樣品的揮發性成反比，揮發性差、沸點高的組分具有更高的靈敏度。

而當使用GC-SAW 進行頂空測試時，除姜烯、姜黃酮具有較高的占比外，α-異松油烯、桉樹醇和反式石竹烯的含量顯著升高。這是因為使用頂空進樣時，揮發性更好的組分在頂空氣相中具有更高的濃度。同樣地，盡管液體樣品中姜黃酮含量很高，由于其較差的揮發性，使其在檢測器上的響應占比低于姜烯和α-異松油烯。

由于受到色譜柱柱長等因素的限制，GC-SAW上檢測姜黃精油時，有5 種化學成分未能完全分離。而在檢測時間上，GC-SAW完成單個姜黃精油樣品的檢測僅需20 s，而GC-MS則需要30 min。從進樣方式上來看，液體進樣可以用于精油中單一組分的準確定量分析，但一方面需要對樣品進行稀釋，增加了檢測時長；另一方面，還需要選擇合適的稀釋倍數，否則由于高沸點組分的存在，容易引起檢測器的停振從而損壞檢測器。而頂空進樣測試，樣品無需進行前處理，直接頂空進樣，有利于現場快速檢測；并且避免了高沸點組分對檢測器的損害。

綜合以上分析，GC-SAW 使用頂空進樣的方式，能夠快速檢測出姜黃精油中的主要成分及其在頂空氣相中的相對含量。GC-SAW能夠實現姜黃精油化學成分的快速檢測，有很好的潛在應用，但檢測條件還需更好的優化與探索。后期將從色譜柱的柱長、升溫速率、載氣流速等方面對色譜分離效果進行改善。

3 結論

本文應用GC-SAW 對姜黃揮發油進行探索性的檢測，樣品無需前處理，直接頂空測試20 s 即可檢出姜黃揮發油中的10 種主要化學成分。使用液體進樣測試姜黃精油中反式石竹烯的含量為5.45 mg/mL。與GC-MS 檢測結果進行對比，姜黃揮發油主要成分的種類一致，由于SAW 檢測器對高沸點組分具有更高的靈敏度，GC-SAW檢測結果中主要成分姜烯和姜黃酮的含量相對更高。實驗考察了GC-SAW檢測姜黃揮發油方法，實現了快速檢測，時間成本低，并能對姜黃精油化學成分達到分離與分析效果，為姜黃揮發油在鑒定與質量控制方面提供實驗基礎。本實驗姜黃揮發油GC-SAW 檢測為可行性方法有潛在應用，實驗中還存在一些不足，后期會根據本實驗的結果進一步優化GC-SAW檢測方法。GC-SAW儀器體積小、易于便攜的特點，將可能為市場上姜黃揮發油的真偽、優劣的鑒別提供一種新的檢測技術。