聯合檢測AchR-Ab和抗橫紋肌抗體對重癥肌無力的診斷價值*

韓 波，朱思綺，朱敬軒，張 程

遼寧中醫藥大學附屬醫院檢驗科,遼寧沈陽 116600

重癥肌無力(MG)是一種多因素調控的器官特異性自身免疫性疾病，其臨床表現為全身或部分骨骼肌無力和易疲勞。流行病學統計提示MG發病率為(0.3～2.8)/100 000，全球約有70萬MG患者，而中國年平均發病率為(8.0～20.0)/100 000。MG的女性患病率較男性高，且在各個年齡階段均可發病。目前，診斷MG在具有臨床特征的基礎上，尚缺乏快速高效的實驗室輔助診斷指標，需要探尋更高靈敏度和(或)特異度的診斷方法，因此，本研究聯合檢測乙酰膽堿受體抗體(AchR-Ab)和抗橫紋肌抗體(AsM-Ab)，評價這兩種血清自身抗體聯合檢測對MG的診斷價值，為臨床提供診斷客觀依據，以便進一步展開治療。

1 資料與方法

1.1一般資料 選擇本院2018年11月至2019年12月初步診斷為MG的患者150例為MG組，其中男55例、女95例，平均年齡(45.65±15.72)歲，眼肌型30例、全身型66例、重度激進型28例、遲發重度型17例、肌萎縮型9例[1]；選擇同期在本院門診和住院的除患有MG之外的其他自身免疫病患者70例為其他自身免疫病組(OAD組)，其中男24例、女46例，平均年齡(41.37±12.66)歲；選取同期體檢健康者80例為健康對照組，其中男28例、女52例，平均年齡(42.16±11.44)歲。各組的年齡、性別比較，差異均無統計學意義(P>0.05)。本研究經本院醫學倫理委員會批準，患者及其家屬均簽署知情同意書。

1.1.1MG的西醫診斷標準[2](1)臨床表現：某些特定的橫紋肌無力，晨輕暮重；(2)藥理學表現：新斯的明試驗陽性；(3)重復神經刺激(RNS)檢查波幅遞減10.00%以上；(4)在多數全身型MG患者血中可檢測到AchR-Ab。在具備典型MG臨床特征的基礎上，同時具備藥理學特征和(或)神經電生理學特征，臨床上則可診斷為MG。有條件的單位可檢測患者血中的AchR-Ab等有助于進一步明確診斷。需要排除發病前3個月內曾使用激素或免疫抑制劑者，伴有其他自身免疫性疾病、其他肌肉疾病或合并心、肺、肝、腎等器官功能疾病及妊娠或哺乳期婦女。

1.1.2MG的臨床分型 改良的Osserman分型[2]Ⅰ型：眼肌型；Ⅱ型：全身型，ⅡA型(輕度全身型),ⅡB型(中度全身型)；Ⅲ型：重度激進型；Ⅳ型：遲發重度型；Ⅴ型：肌萎縮型。

1.2儀器與試劑 抗核抗體譜(IgG)的檢測采用IgG檢測試劑盒(印跡法)[來自歐蒙公司(批號為CD200721AA)]、IgG檢測試劑盒(間接免疫熒光法)[來自歐蒙公司(批號為CF200527AC)]、AchR-Ab酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒[來自英國RSR公司(批號為KAE88A)]、歐蒙熒光顯微鏡EUROStar、酶標儀BIO-RAD(Model 680)。

1.3方法 所有研究對象均空腹采集當日或入院后次日肘正中靜脈血3～5 mL經3 000 r/min離心10 min后，取上清液，保存于-20 ℃冰箱待測。

1.3.1ELISA檢測AchR-Ab (1)分別取待檢血清、陽性對照、陰性對照及校準血清100 μL裝入1.5 mL的Eppendorf管中，并做好相應標記。(2)加入25 μL胎兒型和成人型AchR混合物并密封試管，確保所有液體都在試管底部(可15 000 r/min離心10 s)，振蕩混勻，于2～8 ℃孵育16～20 h。(3)將每管樣品AchR混合物振蕩混勻后，分別取50 μL加入AchR MAb1酶標板中，并留2個孔作為空白對照，在室溫下用ELISA平板搖床(500次/min)孵育1 h。(4)將液體吸出，稀釋液清洗酶標板3次。(5)將50 μL重組AchR MAb生物素加入每孔中(除空白孔外)，置室溫下用ELISA平板搖床(500次/min)孵育1 h。(6)重復步驟(4)。(7)將100 μL抗生蛋白鏈霉素-過氧化物酶(SA-POD)加入每孔中(除空白孔外)，置室溫下用ELISA平板搖床(500次/min)孵育30 min。(8)重復步驟(4)，再用清水洗滌一次后。(9)將100 μL顯色物TMB加入每孔中(包括空白孔)，在室溫下黑暗中放置30 min。(10)將50 μL終止液加入每孔中，在搖板器上搖動約5 s。(11)在30 min內于450 nm波長處讀取每個孔的吸光度，血清抗AchR抗體>0.45 nmol/L即為陽性。

1.3.2間接熒光免疫(IFA)檢測AsM-Ab (1)滴加0.01 mol/L,pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)于已知抗原標本片，10 min后棄去，使標本片保持一定濕度。(2)用PBS緩沖液以1∶100,1∶1 000兩個稀釋倍數稀釋標本。(3)滴加25 μL已稀釋的待檢抗體標本，37 ℃保溫30 min。(4)用PBS沖洗1～2次，于PBS浸泡5 min。(5)用濾紙吸去多余水分，但不使標本干燥，滴加25 μL熒光標記的抗人球蛋白抗體，37 ℃保溫30 min。(6)重復操作4。(7)用濾紙吸去多余水分，滴加1滴緩沖甘油。(8)熒光顯微鏡高倍視野下觀察。觀察標本的特異性熒光強度：(-)無熒光；(±)極弱的可疑熒光；(+)熒光較弱，但清楚可見；(++)熒光明亮；(+++～++++)熒光閃亮。待檢標本特異性熒光染色強度達“++”以上，而各種對照顯示為(±)或(-)，即可判定為陽性。(9)根據判定結果決定標本最終的滴度。

陽性結果(熒光模式)，猴髂腰肌：骨骼肌細胞胞質可見典型的橫紋熒光見圖1。猴心肌：心肌細胞胞質可見典型的橫紋熒光見圖2。

圖1 猴髂腰肌橫紋熒光圖

圖2 猴心肌橫紋熒光圖

1.4統計學處理 上述數據的統計學分析均采用SPSS23.0軟件進行，以臨床診斷為金標準，采用四格表分別計算各自身抗體單項及聯合檢測的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值。3組抗體陽性率比較及分析抗體與臨床表型的關系均采用χ2檢驗，檢驗水準為α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1AchR-Ab、AsM-Ab陽性率的比較 MG組的AchR-Ab、AsM-Ab陽性檢出率明顯高于其他兩組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 AchR-Ab、AsM-Ab陽性率的比較[n(%)]

2.2單項和聯合檢測抗體對診斷MG的效能評價 單項指標比較，AchR-Ab診斷MG的靈敏度高于AsM-Ab，差異有統計學意義(P<0.05)；兩指標聯合檢測診斷MG的靈敏度高于單項檢測，差異有統計學意義(P<0.05)；聯合檢測的特異度、陽性預測值和陰性預測值均高于任意一項單項檢測，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 單項和聯合檢測抗體對診斷MG的效能評價(%)

2.3AsM-Ab與改良Osserman分型的關系 MG組的AsM-Ab陽性率Ⅰ型為16.70%，Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型依次高于Ⅰ型，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 AsM-Ab與改良Osserman分型的關系

3 討 論

MG是一類高發病率的器官特異性自身免疫性疾病，嚴重影響患者的正常生活和身心健康，給社會和家庭帶來了嚴重的負擔。MG患者的臨床和病理表現多樣，發病機制復雜，且由于MG患者的個體化差異，比如病情嚴重程度、發病年齡、體內抗體狀態、并發癥和不良反應等[3]，應給予快速準確的診斷。

MG 的發病機制到目前為止并不十分清楚，其主要病因是患者機體中出現針對神經-肌肉接頭(NMJ)突觸后膜上成分的自身抗體所致，主要是AchR-Ab。AchR是由4種同源亞基構成的跨膜糖蛋白，屬于陽離子通道[4]。人類肌肉有2種類型的AchR，其中胎兒型的亞基組成為 2α、β、δ、γ，成人型中γ亞基被ε亞基所取代[5]。AchR-Ab的主要免疫原區(MIR)在α亞基，其核心部位位于胞外段的第67～76位氨基酸。AchR-Ab大多數為IgG1和IgG3亞型，通過與突觸后膜上的AchR結合，可以激活補體級聯反應，致使突觸后膜受體數目減少[6]，阻斷骨骼肌間神經信號傳導。超過85.00%的全身型MG患者和大約一半的單純眼部肌無力患者都有AchR-Ab[7],且其陽性為診斷MG標準之一，故AchR-Ab為診斷該病的必須檢測項目。

MG患者的外周血中除了AchR-Ab外，還存在多種以肌肉為靶點的抗體，稱為抗肌抗體。有研究表明[8]首先應用免疫熒光技術發現MG患者血清內存在一種與骨骼肌結合的球蛋白因子，有研究[9]表明此種球蛋白因子是IgG，熒光顯微鏡下它與骨骼肌結合的形式呈橫紋狀，稱之為AsM-Ab，有文獻報道其抗體檢測陽性率為47.00%，可應用于MG的診斷[10]。有研究表明，間接免疫熒光法(IFA)檢測抗肌抗體有助于確診疑似MG患者，尤其是患者AchR-Ab陰性時，AsM-Ab的檢測尤為重要[11]。間接免疫熒光法是以純化的猴髂腰肌、心肌細胞作為檢測MG自身抗體的抗原基質，再以熒光示蹤物質標記抗體而進行抗原定位。此方法特異性強、靈敏度高、速度快，與放射免疫(RIPA)相比，其無放射性污染且操作簡單。與免疫印跡法相比，其包含所有骨骼肌細胞及心肌細胞的全部細胞結構，篩查范圍更廣，靈敏度更高。

本研究對150例MG患者、70例其他自身免疫病患者及80例健康對照者的血清標本進行檢測，結果顯示AchR-Ab和AsM-Ab診斷MG的陽性檢出率分別為80.67%和57.33%，均高于OAD組和健康對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。AchR-Ab在MG患者中陽性率高的原因[12]為：(1)補體激活造成AchR破壞和突觸后膜局灶性溶解，導致神經肌肉接頭處終板膜上的AchR和AchR相關蛋白的破壞；(2)封閉乙酰膽堿受體導致其加速內化和降解；(3)AchR 阻斷乙酰膽堿結合位點。AsM-Ab在MG患者中陽性率偏高的原因為，在補體參與下，AsM-Ab與其受體發生應答，經由補體介導的細胞膜溶解作用使骨骼肌成分被大量破壞，影響了神經肌肉組織的信號傳導及肌纖維的收縮，導致肌無力[12]。說明兩種血清自身抗體是診斷MG的標志性抗體，也提示AsM-Ab檢測有助于MG和其他自身免疫病的鑒別，且具有較滿意的診斷價值，是診斷MG的新型免疫學指標，可在臨床推廣應用。其中，AchR-Ab的陽性率高于張鵬等[12]的研究，可能與不同的實驗方法其靈敏度和特異度不同有關；AsM-Ab的陽性率高于朱慧等[9]的研究，可能與間接免疫熒光效價的判斷有關，目前仍采用人工鏡檢的方式判讀結果，且每個實驗室的判讀標準也不盡相同。

本研究同時分析了AsM-Ab與改良Osserman分型之間的關系，發現MG患者Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型的AsM-Ab陽性率依次高于Ⅰ型，且差異有統計學意義(P<0.05)。有學者研究認為，AsM-Ab存在于高達95.00%的胸腺瘤MG患者和50.00%的晚發型無胸腺瘤MG患者[13]，可初步推測AsM-Ab可能預示病情的嚴重程度和(或)伴隨胸腺瘤的發生，尚待進一步的前瞻性研究。

本研究同時對MG患者的AchR-Ab和AsM-Ab進行單項指標檢測，發現AchR-Ab的靈敏度高于AsM-Ab，差異有統計學意義(P<0.05)。由于AsM-Ab的靈敏度(57.30%)較低，單獨檢測一種自身抗體診斷MG的靈敏度和準確性存在局限性，需將兩種抗體聯合檢測，以提高診斷價值。本研究對AchR-Ab、AsM-Ab兩種血清自身抗體聯合檢測，結果顯示聯合檢測時比任意一項陽性時診斷MG的靈敏度明顯升高，差異有統計學意義(P<0.05)，其特異度、陽性預測值及陰性預測值也均較單項檢測有所提高，因此，聯合檢測可大幅度降低漏診率、減少誤診率，具有很高的診斷價值。

綜上所述，AchR-Ab和AsM-Ab是診斷MG的標志性抗體，聯合檢測可提高診斷MG的靈敏度，降低因單項檢測出現的漏診和誤診；同時AsM-Ab可作為判斷患者病情嚴重程度的指標，為臨床進一步開展針對性治療提供重要依據。