1例9p-四體綜合征嵌合型胎兒的遺傳學分析

邱顯榮，申 瑤，林 萃

1.廣東省珠海市婦幼保健院檢驗科，廣東珠海 519001；2.廣東省中醫院珠海醫院檢驗科，廣東珠海 519015

非平衡嵌合體是導致胎兒先天性缺陷的原因之一，傳統的細胞遺傳學檢查可能會漏檢低水平的嵌合體，除非加大核型的分析數量。染色體微陣列分析(CMA)技術的應用能提高染色體異常嵌合的檢出率，能檢出嵌合比例為10%～20%的低水平嵌合[1-2]。衍生染色體，即由2條或以上染色體結構重排，或是由于單條染色體內發生多種畸變而產生，具有完整的著絲粒。但傳統的G顯帶核型分析由于分辨率不高，很難確定衍生染色體片段的來源、大小和斷裂點，更無法檢測出染色體亞顯微結構異常。本研究中，筆者聯合應用核型分析與CMA技術，最終確定胎兒的嵌合比例與衍生染色體的來源，現報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 孕婦，32歲，配偶為非近親。既往體健，否認家族遺傳病史，孕5次，流產3次。曾足月順產一男嬰，健康。孕13周時無創產前DNA檢測(NIPT)報告21、18、13-三體綜合征低風險，但提示9號染色體部分重復，孕22+1周B超提示胎兒宮內發育遲緩，室間隔缺損、單臍動脈、不排除多囊腎、羊水少。孕婦在知情同意下行羊水穿刺術，抽取羊水同時做G顯帶核型分析和基因芯片檢查。

1.2方法

1.2.1NIPT評估胎兒常見染色體非整倍體患病風險 用乙二胺四乙酸抗凝的離心管抽取孕婦外周血5 mL，2～8 ℃低溫條件下離心分離血漿，-70 ℃以下超低溫保存。采用磁珠法DNA提取試劑盒(深圳華大基因)抽提含有胎兒游離DNA的孕婦血漿DNA，使用胎兒染色體非整倍體(T21、T18、T13)檢測試劑盒(深圳華大基因)對母血游離DNA進行特定序列接頭連接、擴增及上機測序，然后通過與陽性判斷值比較進行胎兒21、18、13號染色體非整倍體情況的判斷。應用BGISEQ-500基因測序儀(深圳華大基因)進行測序，測序方法為聯合探針錨定聚合測序法，測序深度為×0.1。

1.2.2G顯帶核型分析 對胎兒取20 mL羊水做常規G顯帶核型分析。用改良原位法培養制備染色體，G顯帶處理。非嵌合體計數20個核型，嵌合體計數100個核型。染色體核型按《2016人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN)》描述。

1.2.3CMA 抽取羊水10 mL，采用QIAamp DNA Mini試劑盒(德國Qiagen公司)提取和純化全基因組DNA，應用Affymetrix 750K試劑盒(美國ThermoFisher公司)對DNA進行酶切、連接、PCR擴增、純化、片段化、標記、雜交等處理，最后應用配套的ChAS軟件分析染色體的拷貝數變異(CNV)。CNV的分析標準是以50個標記、100 kb為最佳臨界值進行分析；雜合性缺失或純合狀態以5 Mb的分辨率進行分析，包含明確印記致病基因的純合狀態區域報告標準染色體片段≥5 Mb，不包含明確印記致病基因的純合狀態區域報告片段為染色體片段≥10 Mb。

1.2.4熒光原位雜交技術(FISH)分析 采用廣州和能生物科技有限公司生產的GSP PD-L1(Red)和CSP9(Green)探針進行原位雜交，經Zeise熒光顯微鏡觀察，FISH軟件照相分析熒光信號。

2 結 果

2.1NIPT檢測結果 21、18、13-三體綜合征篩查低風險，但9號染色體異常。

2.2核型分析結果 胎兒核型為47,Xn,+der(9)del(9)(q21q34)dup(9)(p12p24)[10]/46,Xn[90]。

2.3CMA檢測結果 對羊水行CMA，胎兒在chr9p24.3p13.2位置檢出一段約64.9 Mb的2.43拷貝重復，檢測結果為arr[GRCH37]9P24.3P13.2(208454-68216577)x2-3，涉及DOCK8、KANAK1、DMRT1等164個OMIM基因。

2.4FISH驗證結果 為9號染色體短臂定制探針，對CMA測序結果提示的chr9p24.3p13.2重復片段進行驗證，發現二者結論一致，見圖1。

注：箭頭所示為chr9p24.3p13.2重復。

3 討 論

9p-三體綜合征由RETHOR等[3]應用顯帶技術識別證實并于1970年首次報道。1975年CENTERWALL等[4]確定了9p-三體綜合征的畸變類型，其畸變大多數源自親代的染色體平衡易位，少部分為新發突變。9p-四體綜合征較罕見，在產前診斷羊水穿刺中9p-四體綜合征的檢出率約為0.002%[5]，9p-四體綜合征中約30%為嵌合體[6]。其組成類型主要有：9號染色體整個短臂的等臂、整個短臂和長臂的部分異染色質區的等臂、整個短臂和長臂延伸到部分常染色質區的等臂。迄今為止，已經報道的9p-四體綜合征僅60余例，其中產前診斷病例僅20例[7]。本研究中病例為9號染色體整個短臂的等臂i9(p)。產生機制多為減數分裂Ⅱ期不分離和重排，導致9p的重復和長臂的缺失，從而形成9p等臂，通常為母源性[8]。

9p-四體綜合征的臨床癥狀與9p-三體綜合征相似，如生長發育遲緩、智力嚴重缺陷，具有眼間距寬、眼裂和嘴角下斜、環狀耳等頭面部異常[3]，先天性心臟病、中樞神經系統異常、腎臟異常、骨骼畸形、泌尿生殖器異常等[9-10]。但9p-四體綜合征的存活率更低，表型更嚴重。許多9p-四體綜合征的異常發現源于胎兒出現多種先天性異常而進行染色體核型分析。其中最常見的是巨腦室及Dandy-Walker畸形(60%)，其次依次為唇腭裂(55%)、宮內發育遲緩(45%)[11]。DHANDHA等[12]和NAKAMURA等[13]報道了被診斷為9p-四體綜合征的產前超聲異常還包括腦室增大、胼胝體發育不全、蚓部發育不全、椎體異常、心臟異常、泌尿生殖系統異常、肢體畸形、鼻骨缺失、先天性膈疝等。

9號染色體p22p24區是9p-四體綜合征的關鍵區域。9p22.1p22.3區段重復具有典型顱面部異常，9p21.2p21.3區段重復與語言發育遲滯有關[14]。而9p22p24區段的DOCK8、KANK1、DMRT1、VLOLR基因明確與多種疾病及智力低下有關，KANK1的拷貝數變異與中樞神經系統缺陷有關。BOXILL等[15]認為9p區域包含一個或多個涉及脈絡叢生長調控的基因，與9p-三體綜合征相比，9p-四體綜合征患者似乎更容易發生脈絡叢增生。二者最常見的中樞神經系統異常是胼胝體異常和腦積水。DMRT1基因屬于一個鋅脂樣的DNA結合序列(DM域)，DM域是脊椎動物性別決定途徑中一個古老而保守的組成部分。當該基因出現CNV時，就會出現睪丸發育缺陷和XY女性化。VERHEIJ等[16]認為9號染色體上某些基因的超表達可能導致睪丸功能低下和泌尿生殖系統異常。VLDLR基因可以轉導多種細胞外信號穿過神經細胞膜進入中樞神經系統，調節突觸的可塑性并對海馬的特殊學習和記憶功能具有重要作用。這些基因拷貝數的改變可能對智力和骨骼的發育產生影響[14]。本研究中胎兒核型的衍生染色體經過CMA確認為9p的重復。因其片段覆蓋了9p-四體綜合征的關鍵區域，故會呈現出與之相關的典型癥狀，是其發病的真正原因。

綜上所述，對正在進行介入性產前診斷和基因檢測的父母進行遺傳咨詢時，除了常見的染色體畸變外，還應包括罕見的，但在臨床上同樣重要的相關基因組。高分辨率全基因組掃描技術在臨床中的應用將會明顯提高不明來源復雜染色體畸變的診斷效率，能夠為病因的解釋、個體化的診療和遺傳咨詢提供科學合理的遺傳學依據。