RRx?001介導Nrf2減弱DOX誘導的心肌細胞損傷

周玉玲，曹德康，李震宇，蘇建忠，王欣，潘歡

（1.中國人民武裝警察部隊特色醫學中心突發公共衛生事件醫學防治研究所，北京 102613；2.嘉興市第一醫院，浙江嘉興 314000）

阿霉素（doxorubicin，DOX）和柔紅霉素（dauno?rubicin，DNR）屬于蒽環類抗生素，在臨床上廣泛應用于多種惡性腫瘤的治療，包括白血病、淋巴瘤、乳腺癌、肺癌、膀胱癌和卵巢癌[1]。然而由于阿霉素高累積劑量（>450~550 mg/m2）所引起的心肌毒性，這大大限制了其臨床應用[2]。這種阿霉素治療而導致的醫源性并發癥（心臟損傷）將給患者的生活質量帶來極大的影響，同時，由于多數腫瘤患者運動的缺乏反而可能加速心臟衰竭的發生[3]。

RRx?001是一種無毒、抗腫瘤耐藥的抗腫瘤藥物[4]，目前已進入Ⅲ期臨床實驗[5]。RRx?001不僅能增加腫瘤放療和化療的敏感性[6?8]，且對正常組織具有放射保護作用[9]，這可能和RRx?001選擇性的調控活性氧（ROS）和活性氮（RNS）的釋放，特別是一氧化氮（NO）的釋放有關[10?11]。與正常細胞相比，腫瘤細胞能夠產生更多的ROS，這就迫使機體更加依賴抗氧化物質以維持正常生存，例如還原型谷胱甘肽（GSH）[12]，因此，當機體抗氧化系統損傷時細胞更易受到損傷。相比之下，由于正常細胞的基礎ROS水平較低且抗氧化能力高，正常細胞能夠承受更高水平的氧化應激。缺血再灌注造成的ROS大量釋放是心肌細胞缺血再灌注損傷的主要原因。已有文獻報道，倉鼠心臟缺血再灌注前使用RRx?001預處理可提高心肌細胞活力，減少心肌細胞凋亡[13]。核因子E2相關因子2（Nrf2）是細胞調節抗氧化反應的一種重要轉錄因子，通過抗氧化反應元件（ARE）調控抗化基因的表達，增加細胞對氧化應激的抗性[14]。有研究報道，缺乏Nrf2可加重阿霉素所致心肌毒性和損傷[15]，但在心肌細胞中RRx?001是否影響Nrf2表達尚未報道。

由于約有10%的患者接受了阿霉素或其衍生物的治療，將有可能發展為心臟并發癥[16]，且現有的心臟保護措施不足，迫切需要尋找替代治療策略。Oronsky等[17]最近的研究表明，使用RRx?001預處理可改善阿霉素急性處理誘導的小鼠心肌功能損傷，但具體機制尚不清楚。本文將從細胞水平上探討RRx?001對于阿霉素誘導的心肌細胞毒性是否具有心肌保護作用。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑和儀器

H9c2細胞購自上海中喬新舟生物科技有限公司。阿霉素（doxorubicin，DOX）和RRx?001購自大連美侖生物技術有限公司；ML385購自MedChem?Express公司；Nrf2和GAPDH抗體購自Abcam公司；熒光二抗購自Li?cor公司；MTT試劑盒、Dihy?droethidium超氧化物陰離子熒光探針試劑盒、總SOD活性檢測試劑盒（NBT法）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH?Px）檢測試劑盒、丙二醛（MDA）檢測試劑盒和青鏈霉素混合液購自碧云天生物技術公司；SDS?PAGE凝膠試劑盒購自上海雅酶生物科技有限公司；DMSO溶液購自北京索萊寶科技有限公司；DMEM高糖培養基和胎牛血清購自HyClone公司。酶標儀（ELX800，德國BIOTEK公司）；凝膠電泳儀（1658001/1645050/1703935，美國Bio?Rad公司）；超凈工作臺（B3，蘇州凈化工程設備有限公司）；細胞培養箱（3311，美國Thermo Fisher公司）；化學發光成像系統（GeneGnome XRQ，英國Syngene公司）；細胞破碎儀（Q125，德國Q SONIC公司）；渦旋振蕩器（88880018，美國Thermo Fisher公司）；離心機（Allegra x?12R，美國貝克曼公司）；熒光顯微鏡（DP80/BX43，美國奧林巴斯公司）。

1.2 MTT檢測細胞活力

將H9c2細胞消化轉移至96孔板中，細胞計數，稀釋至每孔約5×103個細胞。待細胞穩定貼壁后，給予相應藥物處理，繼續培養12 h后，棄去上層培養基，并加入100μL純DMEM培養基配置的MTT溶液（500μg/mL）。置于細胞培養箱中靜置4 h。棄去上層MTT溶液，加入150μL DMSO，并混合均勻。使用酶標儀于490 nm處測定吸光度A值，以對照組標準化，檢測細胞活力變化。

1.3 Western blot檢測Nrf2蛋白表達水平

細胞處理完畢后，加入50~100μL細胞裂解液（RIPA∶磷酸酶抑制劑:蛋白酶抑制劑=100∶10∶1），置于冰上裂解15 min，使用細胞刮刀刮下細胞，并轉移至1.5 mLEP管中。使用細胞破碎儀30%頻率破碎細胞5次，每次3 s。之后使用渦旋儀渦旋振蕩3次。4℃離心機13 500 r/min離心15 min。將上層透明液體轉移至新的1.5 mLEP管中，并使用BCA試劑盒用酶標儀在562 nm處測定吸光度值，計算蛋白濃度。之后加入1/5體積的6×Loading Buffer緩沖液，100℃煮5 min后用于后續實驗。使用配膠試劑盒配置適宜濃度的SDS?PAGE凝膠，在每個加樣孔中加入適宜體積的蛋白混合樣品，在100 V恒壓下進行凝膠電泳，待藍色印跡到達凝膠底側時停止電泳。取出凝膠，300 mA恒流轉膜1 h。取出NC膜，放置于PBS緩沖液配制的5%脫脂奶粉溶液，封閉1 h。封閉完畢后，使用3%BSA配制一抗（1:1 000），于4℃冰箱中過夜。過夜后，PBST溶液洗滌，使用5%脫脂牛奶配制二抗孵育液（1:10 000），置于搖床上室溫孵育1 h，此過程中注意避光。二抗孵育完畢后，在避光條件下使用PBST溶液洗滌4次。使用ECL化學發光法掃描蛋白條帶，并統計蛋白條帶灰度值，以對照組做標準化。

1.4 ROS的檢測

使用Dihydroethidium超氧化物陰離子熒光探針檢測細胞中ROS的變化。將處理后的細胞消化備用。使用無血清培養液稀釋dihydroethidium（1∶1 000），終濃度為10μmol/L。將收集好的細胞懸浮于稀釋好的dihydroethidium，細胞密度為1.0×106~2.0×107。37℃細胞培養箱內孵育15 min。用熒光顯微鏡于535 nm激發波長處觀察熒光強度并拍照，并使用Image Pro Plus軟件統計熒光強度。

1.5 SOD、GSH?Px和MDA的檢測

細胞中SOD、GSH?Px和MDA水平分別使用總SOD活性檢測試劑盒（NBT法）、GSH?Px檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒檢測，根據試劑盒說明書進行操作檢測。

1.6 數據統計

實驗結果以±s表示，使用GraphPad Prism 7軟件進行統計及圖表繪制。兩組間的比較使用t配對/非配對檢驗，多組間的使用方差分析（one?way ANOVA followed by Newman?Keules）。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 RRx?001對阿霉素誘導心肌細胞毒性的影響

培養H9c2大鼠心肌細胞，給予0、0.05、0.1、0.5、1、5μmol的阿霉素12 h誘導心肌細胞損傷，圖1結果顯示阿霉素劑量依賴性地抑制細胞活力，誘導心肌細胞損傷。而使用1μmol/L的RRx?001預處理H9c2細胞1 h后再加入阿霉素處理細胞，相比于阿霉素單獨處理，RRx?001可減弱阿霉素（0.1、0.5、1、5μmol）誘導的心肌細胞毒性，說明RRx?001對于阿霉素誘導的心肌細胞毒性具有心肌保護作用。

圖1 RRx?001減弱阿霉素誘導的心肌細胞毒性Figure 1 RRX?001 attenuates DOX?induced cardiac cytotox?icity(n=6)

2.2 RRx?001對Nrf2表達的影響

圖2 A中Western blot檢測結果顯示，阿霉素（5μmol/L）處理H9c2細胞12 h后顯著降低細胞中Nrf2的蛋白表達，而使用RRx?001（1μmol/L）預處理1 h后，阿霉素（5μmol/L）誘導的Nrf2蛋白表達下降被顯著逆轉，且該逆轉作用可被Nrf2特異性抑制劑ML385（1μmol/L）抑制。同時圖2B中MTT結果顯示RRx?001（1μmol/L）可顯著逆轉阿霉素（5μmol/L）所誘導的心肌細胞損傷，但與RRx?001同時給予Nrf2特異性抑制劑ML385（1μmol/L）時，RRx?001（1μmol/L）的心肌保護作用被取消，說明RRx?001通過激活Nrf2發揮心肌保護作用，減弱阿霉素誘導的心肌細胞毒性作用。

圖2 RRx?001對Nrf2的表達影響Figure 2 Effect of RRx?001 on the expression of NRF2(n=6)

2.3 RRx?001對阿霉素誘導的ROS、SOD、GSH?px及MDA變化的影響

圖3 結果顯示，阿霉素（5μmol/L）可顯著增加H9c2細胞中ROS的生成，而使用RRx?001（1μmol）預處理后，和阿霉素單獨處理相比，阿霉素誘導的ROS的增多被顯著抑制。同時，阿霉素（5μmol/L）處理H9c2細胞12 h后，細胞內抗氧化因子SOD、GSH?px水平下調，MDA水平上調，給予RRx?001（1μmol/L）預處理1 h后，和阿霉素（5μmol/L）組相比，H9c2細胞內SOD、GSH?px水平顯著上調，MDA水平被抑制（表1）。基于上述結果，RRx?001可通過上調Nrf2表達，增強H9c2細胞的抗氧化能力，上調細胞內SOD和GSH?Px水平，抑制細胞內MDA水平，控制ROS的過量生成，進而減弱阿霉素誘導的心肌細胞損傷。

表1 RRx?001對阿霉素誘導的氧化應激因子表達變化的影響Table 1 Effect of RRX?001 on the expression of oxidative stress factors induced by DOX(n=6)

3 討論

腫瘤依然是世界上威脅人類健康的主要疾病，而阿霉素作為一種多腫瘤抗癌藥物，由于其副作用導致其臨床應用大大受限。右雷佐生作為臨床上用于減輕或減少蒽環類抗生素（如阿霉素）化療引起的心肌毒性的一種抗腫瘤輔助藥品，由于其可能削弱阿霉素的抗腫瘤活性也被限制了應用[18]。文獻報道，腎素?血管緊張素系統的紊亂可能是蒽環類抗生素引起心臟毒性的原因，但血管緊張素受體抑制劑和血管緊張素轉換酶抑制劑已知的抗氧化特性，在理論上也可以抵消對腫瘤細胞的化學治療作用[19]。相比之下，RRx?001作為一個抑制腫瘤耐藥，且已經進入Ⅲ期臨床實驗的抗腫瘤藥物，不僅對正常細胞或組織具有保護作用，還可選擇性地殺死腫瘤細胞，具有巨大的臨床價值。本研究結果表明，RRx?001可以減弱阿霉素誘導的心肌細胞毒性，其中Nrf2參與了RRx?001的心肌保護作用，RRx?001可逆轉阿霉素誘導的Nrf2表達下調，促進SOD和GSH?Px抗氧化因子的生成，抑制MDA的水平，調控ROS的過量生成。同時還可以看出，將RRx?001運用到癌癥患者的新輔助治療時具有2個優勢，RRx?001不僅可以減輕阿霉素治療引起的心臟毒性，還能加強阿霉素對于腫瘤的殺傷作用。

Nrf2作為一類重要的抗氧化轉錄因子，能夠調節下游抗氧化蛋白的表達以抵抗氧化應激損傷。在正常條件下，Nrf2與Keap1結合，存在于細胞之中，發生氧化應激時，Keap1的半胱氨酸殘基被修飾，改變構象導致Nrf2釋放出來，進入細胞核中，與ARE結合后，促進下游抗氧化酶的基因轉錄，例如醌氧化還原酶1、血紅素加氧酶1和谷胱甘肽S?轉移酶等。本研究結果顯示，阿霉素處理后的H9c2細胞中Nrf2的表達下降，RRx?001可逆轉阿霉素誘導的Nrf2表達下降；同時阿霉素可引起H9c2細胞氧化應激增多，ROS過量生成，表現為SOD、GSH?Px活性降低，MDA水平增高，而給予RRx?001預處理后，抗氧化能力增強，ROS水平被抑制，說明RRx?001通過激活Nrf2，降低了阿霉素誘導的H9c2心肌細胞損傷和氧化應激的作用。

綜上所述，RRx?001可通過增加H9c2細胞中Nrf2表達，增強細胞抗氧化能力，減弱阿霉素誘導的心肌細胞損傷，這對于研究阿霉素心肌細胞損傷的治療及作用機制具有重要意義。