10?羥基?α?癸烯酸對氧化應激損傷血管內皮細胞的保護作用

黃瓊，馬心超，袁義強

（河南省胸科醫(yī)院，河南鄭州 450000）

近年來，心血管疾病發(fā)病呈年輕化趨勢，已經(jīng)嚴重危害人類的健康，不但給患者帶來經(jīng)濟負擔，還給人類的健康帶來了巨大的威脅[1]。國家心血管病中心組織編撰的《中國心血管病報告2018》統(tǒng)計我國心腦血管病現(xiàn)患人數(shù)2.9億，其中腦卒中1 300萬，冠心病1 100萬，肺源性心臟病500萬，心力衰竭450萬，風濕性心臟病250萬，先天性心臟病200萬，高血壓2.7億[2]。動脈粥樣硬化和高血壓等多種心血管疾病的發(fā)生是因為血管內皮細胞的損傷導致的，而氧化應激和細胞凋亡可直接造成內皮細胞損傷現(xiàn)象的出現(xiàn)，也就是說氧化應激和細胞凋亡會直接導致多種心血管疾病的發(fā)生[3]。10?羥基?α?癸烯酸（10?hydroxy?2?decenoic acid，10?HDA）是一種在蜂王漿中發(fā)現(xiàn)的一種獨特的脂肪酸，由于其他蜂產(chǎn)品不含10?HDA，所以其存在可以作為區(qū)分蜂王漿與其他蜂產(chǎn)品的一個指標。10?HDA具有抗腫瘤、促進膠原蛋白、免疫調節(jié)、抗菌和抗炭疽等多種生理活性[4]。有研究報道指出，10?HDA在人結腸癌細胞中具有殺菌和抗炎活性；同時10?HDA還具有治療類風濕關節(jié)炎的潛力，能夠通過下調PI3K?AKT通路來抑制類風濕性滑膜細胞增殖[5]。同時10?HAD因其獨特的分子結構，具有抗氧化活性，清除機體中多余的氧化自由基的功效[6]。本研究在建立體外內皮細胞過氧化氫（H2O2）損傷的基礎上，探討10?HAD對氧化所致的血管內皮細胞損傷的影響，并進一步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞

人臍靜脈血管內皮細胞株EVC304購自中國科學院細胞研究所。

1.2 藥品與試劑

10?HDA（CAS：14113?05?4，貨號：YS014080）購自湖北廣奧生物科技有限公司；H2O2溶液（30%，貨號：216763）和BCA蛋白濃度測定試劑盒（貨號：AR0146）購自上海鈺博生物科技有限公司；FBS胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶和青/鏈霉素（P/S）購自北京泰新生物科技有限公司；實驗所用一抗抗體均購自上海愛必信生物科技有限公司；HRP辣根過氧化物酶標記的IG二抗購自中國北京中杉金橋生物技術有限公司；CCK?8試劑盒（貨號：LHK900）購自上海宇淳生物科技有限公司；細胞凋亡試劑盒（貨號：556547）、一氧化氮（NO）試劑盒（貨號：584159）、丙二醛（MDA）試劑盒（貨號：358418）、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（貨號：574158）和ECL發(fā)光液（貨號：325874）購自南京森貝伽生物科技有限公司。

1.3 細胞系與細胞培養(yǎng)

將含10%FBS，1%P/S的DMEM培養(yǎng)液加入EVC?304細胞，并將培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO2飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中。待細胞滿度為70%~80%左右，利用胰蛋白酶消化離心后傳代。

1.4 實驗分組及H2O2損傷模型的建立

取對數(shù)生長期的EVC?304細胞經(jīng)消化制成細胞懸液，以1×105個/孔接種于96孔板中，隨機分為空白對照組（不作任何處理）、H2O2模型組（100 μmol/L H2O2）和10?HAD低、中、高劑量組（10、30、50 μmol/L），各組培養(yǎng)條件保持完全一致，模型組H2O2濃度為100μmol/L作為造模濃度，10?HAD低、中、高劑量組分別用10?HDA 10、30、50μmol/L+H2O2100μmol/L。

1.5 CCK?8實驗檢測細胞增殖抑制率

按照“1.4”的方法建立H2O2損傷模型并加藥處理24 h后，將10μL CCK?8試劑加入孔中并在37℃下孵育1.5 h。隨后，通過酶標儀在490 nm處測量吸光度（A），并計算細胞存活率。增殖抑制率=｛1?（實驗組A空白調零組A/對照組A?空白調零組A）｝×100%。

1.6 流式細胞術檢測10?HAD對內皮細胞活性氧（ROS）的影響

按照“1.4”的方法建立H2O2損傷模型并加藥處理24 h后，將細胞收集到Tube管中，離心并棄去上清，加PBS重懸并洗滌1次，隨后加入5μL的DCFH?DA，隨后置于37℃條件下避光孵育30 min，離心重懸，流式細胞儀檢測細胞內ROS水平。

1.7 ELISA法測定細胞中NO、MDA的含量和SOD的活性

前期處理同“1.4”，模型建立后藥物處理1 d，隨后用PBS洗滌2次，分別將各組細胞裂解液收集，高速離心，保留離心后的上清液，按照試劑盒說明書，分別檢測相同體積細胞上清液中NO、MDA的含量和SOD的活性。

1.8 流式細胞術檢測10?HAD對內皮細胞凋亡的影響

按照“1.4”的方法建立H2O2損傷模型并加藥處理不同時間（3、6、12、24 h）后，用胰酶消化，離心，收集細胞并進行Annexin V?FITC和PI染色，染色方法參照試劑盒，最后于流式細胞儀上檢測分析。

1.9 Western blot檢測蛋白變化情況

前期處理同“1.4”，到處理時間后，收集各組EVC?304細胞，以PBS洗2次，用PIPA細胞裂解液置冰浴裂解，4℃離心機中以12 000 r/min離心30 min，收集上清。利用BCA試劑盒定量，沸水浴變性5 min，SDS?PAGE分離目標蛋白，上樣量為20μL。轉至PVDF膜上，TBST漂洗后，5%脫脂奶粉封閉液封閉2 h，孵一抗抗過夜，TBST漂洗5次（每次5 min），加入二抗搖床孵育1 h，TBST漂洗5次（每次5 min），用ECL顯影液顯色，最后顯影拍照，并用Image J軟件對圖片進行分析。

1.1 0統(tǒng)計學分析

采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料數(shù)據(jù)以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 10?HAD對H2O2誘導的血管內皮損傷細胞活力的影響

結果如表1所示，在24 h，與空白對照組相比，模型組細胞增殖率顯著下降（P<0.01），說明實驗造模成功；與模型組相比，10?HAD組細胞增殖率均顯著提高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），且10?HDA濃度越高，效果越顯著，呈劑量依賴性，高濃度的10?HDA（50μmol/L）促進細胞增殖作用最顯著（P<0.01）。

表1 10?HAD對H2O2誘導的血管內皮損傷細胞活力的影響Table 1 Effect of 10?HDA on the viability of vascular endo?thelial cells injured by H2O2

2.2 10?HAD對H2O2損傷的EVC?304細胞中ROS水平的影響

如圖1所示，流式細胞術檢測結果示，與對照組比較，模型組細胞的平均熒光強度顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明H2O2可誘導胞內ROS升高；與模型組比較，10?HAD組細胞的平均熒光強度顯著下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01），表明10?HAD能減少H2O2誘導胞內ROS的生成。

圖1 10?HAD對H2O2損傷的EVC?304細胞中ROS水平的影響Figure 1 Effect of 10?HDA on the apoptosis of EVC?304 cells induced by H2O2

2.3 10?HAD對H2O2損傷的EVC?304細胞上清液中NO、MDA的含量和SOD活性的影響

結果如表2所示，與空白對照組相比，模型組中EVC?304細胞上清液中NO、SOD活性明顯下降，而MDA的含量大幅度升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；與模型組比較，10?HAD組能提高細胞上清液中的NO含量和SOD活性，下調MDA活性，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

表2 10?HAD對H2O2損傷的EVC?304細胞上清液中NO、MDA的含量和SOD活性的影響Table 2 Effect of 10?HDA on the content of NO，MDA and the activity of SOD in the supernatant of EVC?304 cells injured by H2O2（x±s）

2.4 10?HAD對H2O2損傷后血管內皮細胞凋亡率的影響

如圖2所示，與空白對照組相比，模型組中血管內皮細胞凋亡率顯著增加，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。在10?HAD處理組中，隨著10?HAD處理濃度的增加，H2O2損傷后內皮細胞凋亡率呈現(xiàn)濃度依賴性的降低，與模型組相比，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。說明10?HAD能夠抑制H2O2誘導的血管內皮細胞凋亡。并進一步檢測了細胞中凋亡相關蛋白的表達量變化情況，Bax的表達量和Bax/Bcl?2的比值顯著降低，Bcl?2的表達量顯著升高，且10?HAD濃度越高，效果越明顯，呈劑量依賴性，10?HAD組與模型組相比，cleaved Caspase?3的表達含量顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。

圖2 10?HAD對H2O2損傷后血管內皮細胞凋亡的影響Figure 2 Effect of 10?HDA on the apoptosis of EVC?304 cells injured by H2O2

2.5 10?HAD對Nrf2、HO?1信號通路蛋白表達的影響

如圖3所示，對照組中Nrf2、HO?1蛋白呈少量表達，模型組Nrf2和HO?1蛋白表達與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。10?HAD組明顯上調Nrf2、HO?1蛋白表達，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義。

圖3 10?HAD上調H2O2損傷后血管內皮細胞Nrf2/HO?1信號通路蛋白的表達Figure 3 Effect of 10?HDA on the expression of Nrf2/HO?1 signaling pathway proteins in vascular endothelial cells after H2O2 injury

3 討論

完整的血管內皮系統(tǒng)是心血管系統(tǒng)維持穩(wěn)態(tài)的基石，血管內皮細胞的緊密結合保證了血管壁通透性完整，同時也使血管舒張和收縮處在一個平衡狀態(tài)，參與各組織器官營養(yǎng)物質供應與廢物清理等多項生理進程，內皮細胞損傷與功能失常可導致多種疾病的發(fā)生。氧化應激是最常見的內皮損傷因素，降低氧化應激反應能夠很大程度上降低細胞損傷程度，而近年來的研究都證實天然來源的物質可以在降低氧化應激損傷過程中起到較強的作用，被公認為是血管內皮細胞氧化應激損傷的可靠研究方向[7?8]。

本研究利用100μmol/LH2O2損傷EVC?304細胞構建氧化應激損傷模型進行研究。SOD和MDA是氧化應激反應的直接表現(xiàn)因素，MDA是脂質過氧化物，其過量會對細胞產(chǎn)生損傷作用；SOD是體內清除自由基的抗氧化酶，不但能夠將自由基消解還抑制脂質過氧化反應；NO是由內皮細胞的線粒體產(chǎn)生的“信使分子”，改善機體的代謝，在維持內皮細胞穩(wěn)態(tài)以及免受傷害方面作用很大。CCK?8實驗結果和ELISA實驗結果表明，H2O2引起的氧化應激損傷使EVC?304細胞的存活率顯著降低，ROS水平升高，NO、SOD活性明顯下降，而MDA的含量大幅度升高。在加入10?HAD之后可顯著提高H2O2損傷的EVC?304細胞的存活率，降低細胞ROS和MDA水平，提高細胞上清液中的NO含量和SOD活性，表明10?HDA可以減輕EVC304的氧化應激損傷，增強細胞的抗氧化能力。

細胞凋亡是指細胞由基因調控的細胞死亡，是維持機體內環(huán)境穩(wěn)定的重要生理進程，與這一進程關系最為密切的包括Bcl?2、Caspase兩大家族[9]。通過Annexin V?FITC配合PI進行雙染，并利用流式細胞儀檢測細胞凋亡情況，反映細胞凋亡的進程。本實驗發(fā)現(xiàn)，H2O2損傷EVC?304細胞后，細胞早期凋亡和晚期凋亡數(shù)目均大幅增大。而10?HAD組中凋亡細胞隨著10?HDA處理濃度的升高而減少，說明10?HDA具有明顯抵抗H2O2誘導的細胞凋亡作用。在蛋白分子水平的檢測中，10?HDA能夠抑制H2O2誘導的Caspase?3蛋白的活化，增加抗凋亡蛋白Bcl?2的表達，降低Bax和Bax/Bcl?2的比值，表明10?HDA抑制H2O2引起的線粒體途徑細胞凋亡。

Nrf2/ARE是機體內重要的內源性抗氧化應激通路，Nrf2即核因子E2相關因子2，是氧化應激基本表達的關鍵轉錄因子；ARE是抗氧化反應元件，是一個特異的DNA?啟動子結合序列，當機體氧化應激反應發(fā)生后，Nrf2受到多種蛋白的調控轉移到細胞核中，與ARE結合后直接調控HO?1啟動轉錄，從而發(fā)揮抗氧化作用[10?11]。本實驗對這兩條信號通路進行了檢測，從實驗結果中可以看出，與模型組相比，10?HAD組Nrf2/ARE抗氧化信號通路中關鍵分子Nrf2及HO?1表達增多，因此推測10?HDA能夠調節(jié)Nrf2/ARE信號通路來發(fā)揮抗氧化效應。

本實驗證明了10?HAD可以提高損傷的血管內皮細胞的增殖率，增加細胞內抗氧化酶的活性，抑制細胞凋亡，并激活Nrf2/ARE抗氧化信號通路。為研究10?HAD在保護心血管疾病中的應用提供了一定的實驗基礎。