幽門螺桿菌感染性胃癌組織microRNA-17、microRNA-490-3p的表達及其與臨床病理特征和預后的關系

李麗萍，賈筠

（東莞市人民醫院腫瘤內科，廣東東莞523000）

胃癌是全球最常見的消化道惡性腫瘤之一。我國胃癌的發病率和病死率均較高，已成為威脅人民生命健康的公共衛生問題[1]。胃炎、胃潰瘍、不典型增生、癌前病變和胃癌的疾病演進過程中，幽門螺桿菌（Helicobacter pylori,Hp）均發揮關鍵作用[2]，探討Hp 陽性胃癌的發生、發展機制，尋找新的治療、預后預測標志物，對延長Hp 陽性胃癌患者的生存時間有重要意義。

MicroRNA 成為研究腫瘤靶向治療的新方向。研究證實，胃癌發生、發展過程中涉及多種microRNA 異常表達[3]。姜雙等[4]發現胃癌組織中microRNA-17（miR-17）呈高表達，但miR-17 在Hp陽性胃癌中的表達及其與患者預后的關系研究甚少；microRNA-490-3p（miR-490-3p）作為抑癌因子，在消化系統腫瘤中發揮作用，如miR-490-3p 表達降低可減弱細胞克隆形成能力、抑制細胞增殖[5]，沉默miR-490-3p 表達可促進Hp 陽性胃癌的惡性進展。本研究探討miR-17、miR-490-3p 在Hp陽性胃癌組織中的表達及其與腫瘤進展、預后的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月—2014年6月東莞市人民醫院收治的行手術切除的胃癌患者146 例，收集其胃癌組織及癌旁組織。根據Warthin-Starry 銀染結果，Hp陽性胃癌患者97 例（62 例患者接受抗Hp 治療，35 例患者未接受抗Hp 治療），Hp 陰性胃癌患者49 例。Hp 陽性胃癌患者中，男性62 例，女性35 例；年齡26～76 歲，平均（49.57±10.34）歲。Hp 陰性胃癌患者中，男性31例，女性18例；年齡24～78歲，平均（50.42±11.45）歲。Hp 陽性胃癌患者與Hp 陰性胃癌患者的年齡、性別等一般資料比較，差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究以患者出院為起點，對患者進行為期1～60 個月隨訪。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，患者家屬簽署知情同意書。納入標準：具有完整的病歷資料和隨訪資料，術前未接受放化療，經病理檢查確診。排除標準：合并其他惡性腫瘤，合并糖尿病等慢性疾病。

1.2 試劑與儀器

Trizol 試劑（購自美國賽默飛世爾科技公司），Applied BiosystemTMSYBRTM試劑盒（購自美國應用生物系統公司），微量紫外分光光度計（購自美國賽默飛世爾科技公司），實時熒光定量聚合酶鏈反應（qRT-PCR）儀（購自美國應用生物系統公司）。

1.3 qRT-PCR檢測miR-17、miR-490-3p mRNA的相對表達量

切取0.1 g 胃癌組織及癌旁組織的組織標本至小燒杯內，剪碎組織塊后，轉移至玻璃勻漿管中，上下轉動研磨，充分研碎。取100 μl 組織勻漿至EP 管中，加入900 μl Trizol 試劑，依次加入氯仿、異丙醇、無水乙醇，提取組織總RNA，微量紫外分光光度計檢測RNA 純度和濃度。采用Applied BiosystemTMSYBRTM試劑盒，配制qRT-PCR 反應體系，反應條件：95℃預變性20 s，95℃變性10 s；60℃退火20 s；70℃延伸10 s；共40 個循環。以U6為內參。miR-17 引物序列，正向：5'-GATAACAGG CAAGCTTTGAGG-3'，反向：5'-CTGCAAAGATTGTT TGCGAGA-3'；miR-490-3p 引物序列，正向：5'-GCAAACAACCAUUCGGCUGUC-3'，反向：5'-CGCA GGTCCGGAGTAGGT-3'；U6引物序列，正向：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向：5'-AACGCTTCA CGAATTTGCG-3'。2-ΔΔCt法計算miR-17、miR-490-3p mRNA 相對表達量。重復實驗3 次。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 22.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較采用t檢驗或方差分析；相關分析用Pearson 法；Kaplan-Meier 繪制生存曲線，比較采用Log-rank χ2檢驗；影響因素的分析采用多因素Cox 回歸模型。P<0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 胃癌組織和癌旁組織miR-17、miR-490-3p mRNA 相對表達量比較

Hp 陽性胃癌患者癌組織miR-17 mRNA 相對表達量與癌旁組織比較，差異有統計學意義（P<0.05），癌組織高于癌旁組織；Hp 陽性胃癌患者癌組織miR-490-3p mRNA 相對表達量與癌旁組織比較，差異有統計學意義（P<0.05），癌組織低于癌旁組織（見表1）。Hp 陰性胃癌患者癌組織miR-17 mRNA 相對表達量與癌旁組織比較，差異有統計學意義（P<0.05），癌組織高于癌旁組織；Hp 陰性胃癌患者癌組織miR-490-3p mRNA 相對表達量與癌旁組織比較，差異有統計學意義（P<0.05），癌組織低于癌旁組織（見表2）。

表1 Hp陽性胃癌患者癌組織與癌旁組織miR-17、miR-490-3p mRNA相對表達量的比較 （n=97，±s）

表1 Hp陽性胃癌患者癌組織與癌旁組織miR-17、miR-490-3p mRNA相對表達量的比較 （n=97，±s）

組別miR-17 mRNA miR-490-3p mRNA癌組織癌旁組織t 值P 值4.695±1.528 1.642±0.419 18.978 0.000 0.518±0.327 1.439±0.368-18.426 0.000

表2 Hp陰性胃癌患者癌組織與癌旁組織miR-17、miR-490-3p mRNA相對表達量的比較 （n=49，±s）

表2 Hp陰性胃癌患者癌組織與癌旁組織miR-17、miR-490-3p mRNA相對表達量的比較 （n=49，±s）

組別miR-17 mRNA miR-490-3p mRNA癌組織癌旁組織t 值P 值2.647±1.347 1.724±0.427 4.572 0.000 0.792±0.416 1.527±0.391-9.012 0.000

2.2 不同胃癌組織miR-17、miR-490-3p mRNA表達的相關性

經Pearson相關分析，在Hp 陽性胃癌組織中miR-17和miR-490-3p mRNA的表達無相關性（r=-0.056，P=0.585），在Hp 陰性胃癌組織中，miR-17和miR-490-3p mRNA 的表達無相關性（r=-0.134，P=0.360）。見圖1。

圖1 Hp陽性及Hp陰性胃癌組織miR-17、miR-490-3p mRNA表達的散點圖

2.3 不同臨床病理特征Hp 陽性胃癌患者癌組織miR-17、miR-490-3p mRNA相對表達量的比較

不同腫瘤直徑、淋巴結轉移、遠處轉移及TNM 分期的Hp陽性胃癌患者癌組織miR-17 mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義（P<0.05）；不同年齡、性別、分化程度、浸潤深度、病理類型的Hp 陽性胃癌患者癌組織miR-17 mRNA 相對表達量比較，差異無統計學意義（P>0.05）。不同腫瘤直徑、淋巴結轉移及遠處轉移的Hp陽性胃癌患者癌組織miR-490-3p mRNA相對表達量比較，差異有統計學意義（P<0.05）；不同年齡、性別、分化程度、浸潤深度、病理類型、TNM分期Hp陽性胃癌患者癌組織miR-490-3p mRNA相對表達量比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。

表3 不同臨床病理特征Hp 陽性胃癌患者癌組織miR-17、miR-490-3p mRNA 相對表達量的比較 （±s）

表3 不同臨床病理特征Hp 陽性胃癌患者癌組織miR-17、miR-490-3p mRNA 相對表達量的比較 （±s）

臨床病理特征年齡<60歲≥60歲性別n miR-17 mRNA t/F 值P 值miR-490-3p mRNA t/F 值P 值56 41 4.859±1.628 4.471±1.427 1.221 0.113 0.571±0.321 0.519±0.331-0.030 0.488男女62 35 4.761±1.729 4.578±1.547 0.519 0.302 0.531±0.362 0.495±0.317 0.491 0.312腫瘤直徑<5 cm≥5 cm分化程度低分化中、高分化浸潤深度黏膜下層漿膜層病理類型腺癌印戒細胞癌黏液癌淋巴結轉移49 48 4.324±1.347 5.073±1.749-2.366 0.010 0.581±0.394 0.454±0.295 1.794 0.038 38 59 4.627±1.476 4.739±1.605-0.346 0.365 0.522±0.332 0.515±0.317 0.104 0.549 58 39 4.719±1.527 4.659±1.634 0.184 0.427 0.508±0.317 0.533±0.328-0.376 0.354 76 19 2 4.721±1.637 4.624±1.527 4.385±1.468 0.066 0.936 0.517±0.329 0.521±0.331 0.528±0.308 0.002 0.998是否48 49 5.137±1.829 4.262±1.507 2.574 0.006 0.460±0.302 0.575±0.362-1.697 0.046遠處轉移是否43 54 5.087±1.811 4.382±1.479 2.111 0.019 0.451±0.311 0.571±0.352-1.755 0.041 TNM分期Ⅰ、ⅡⅢ、Ⅳ65 32 4.475±1.527 5.142±1.726-1.937 0.028 0.526±0.329 0.502±0.314 0.343 0.366

2.4 miR-17、miR-490-3p表達與Hp陽性胃癌患者生存預后的關系

以miR-17 mRNA 相對表達量的中位數（4.249）為界，將Hp 陽性胃癌患者分為miR-17 低表達Hp陽性胃癌組（48 例）和miR-17 高表達Hp 陽性胃癌組（49 例）。miR-17 低表達Hp 陽性胃癌組的術后5年生存率為47.92%（23/48），術后中位生存時間為40.67 個月；miR-17高表達Hp陽性胃癌組的術后5年生存率為20.41%（10/49），術后中位生存時間為32.22 個月。兩組5年生存率比較，差異有統計學意義（χ2=6.225，P=0.013）。以miR-490-3p mRNA 相對表達量的中位數（0.509）為界，將Hp 陽性胃癌患者分為miR-490-3p 低表達Hp 陽性胃癌組（48 例）和miR-490-3p 高表達Hp 陽性胃癌組（49 例）。miR-490-3p 低表達Hp 陽性胃癌組的術后5年生存率為20.83%（10/48），術后中位生存時間為29.42 個月；miR-490-3p 高表達Hp 陽性胃癌組的術后5年生存率為46.94%（23/49），術后中位生存時間為42.74個月。兩組5年生存率比較，差異有統計學意義（χ2=10.781，P=0.001）。見圖2。

圖2 不同miR-17、miR-490-3p表達Hp陽性胃癌患者的生存曲線

2.5 影響Hp陽性胃癌患者預后的危險因素

以Hp 陽性胃癌患者為樣本（n=97），患者預后為因變量（死亡=1，存活=0，生存期：t），腫瘤直徑、淋巴結轉移、遠處轉移、TNM 分期、miR-17 表達、miR-490-3p 表達為自變量，以miR-17 mRNA相對表達量的中位數（4.249）、miR-490-3p mRNA相對表達量的中位數（0.509） 為界進行分層，miR-17、miR-490-3p 表達轉化成兩分類變量，納入多因素Cox 回歸模型，采用逐步后退法，以行自變量的選擇和剔除（α入=0.05，α出=0.10）。結果：有遠處轉移[H^R=2.824（95% CI：2.700，2.984）]、較高的TNM 分期[H^R=1.793（95% CI：1.703，1.883）]、miR-17 高表達[H^R=2.517（95% CI：2.391，2.643）]和miR-490-3p 低表達[H^R=1.579 （95% CI：1.550，1.608）]是影響Hp 陽性胃癌患者預后的危險因素（P<0.05）。見表4。

表4 Hp陽性胃癌患者預后影響因素的多因素Cox回歸模型參數

3 討論

miR-17-92 基因簇是定位于染色體13q31 的多順反子miRNA 基因，在人類腫瘤中表達最廣泛，可促進細胞增殖、細胞周期進程、細胞侵襲遷移等，主要包括miR-17、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a、miR-92 共6 種miRNA[6]。目前發現，miR-17-92 基因簇與血管異常及冠狀動脈疾病相關[7]，降低miR-17 有助于改善血管功能[8]，而miR-17 高表達則會引起冠心病患者術后血管再狹窄的形成。

研究表明，胃癌患者血清miR-17 表達升高，且過表達miR-17 可促進胃癌細胞增殖[9-10]。miR-17具有作為胃癌診斷靶標的潛能[11-12]。本研究發現Hp 陽性胃癌患者癌組織miR-17 mRNA 相對表達量較癌旁組織升高，且在腫瘤直徑≥5 cm、有淋巴結轉移、有遠處轉移及高TNM 分期的Hp 陽性胃癌患者癌組織中相對表達量升高，提示miR-17 可能通過促進細胞增殖、侵襲加速病情惡化。ZHANG等[13]研究證實miR-17 可調節UBE2C基因表達，參與胃癌細胞增殖調控。miR-17 通過死亡效應結構域DNA 結合蛋白（death effector domain DNA-binging protein,DEDD）依賴的機制，參與胃癌細胞的上皮間質轉化過程[14]。NOORMOHAMMAD 等[15]證實miR-222 在Hp 陽性及Hp 陰性胃癌組織中的表達差異無統計學意義，提示miR-222 表達可能與Hp 感染無關。miR-17 表達是否與Hp 感染有關，其具體分子機制仍需深入探究。

miR-490-3p 作為抑癌因子，能顯著抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡[16]，在結腸癌組織中低表達[17]。本研究結果發現Hp 陽性胃癌患者癌組織miR-490-3p mRNA 相對表達量較癌旁組織降低，且在腫瘤直徑≥5 cm、有淋巴結轉移及有遠處轉移的Hp 陽性胃癌患者癌組織中相對表達量降低，表明miR-490-3p 在胃癌細胞增殖、侵襲轉移的分子調控中發揮作用。SHEN 等[18]的研究證實，表觀沉默miR-490-3p 可誘導Hp 感染性胃癌形成。研究證實，Hp 可降低miR-141 表達，進而誘發胃癌細胞化療耐藥[19]，Hp 感染導致miR-203 表達下降，促進胃癌細胞增殖、侵襲[20]。筆者分析Hp 感染可能導致miR-490-3p 表觀沉默，降低miR-490-3p 表達，調控下游基因表達，如AKT1基因[21]，進而參與胃癌細胞增殖、侵襲等過程調控。

本研究結果發現，miR-17 高表達Hp 陽性胃癌組及miR-490-3p 低表達Hp 陽性胃癌組患者的術后5年生存率及中位生存時間均較差，提示miR-17高表達、miR-490-3p 低表達均與患者不良預后有關；進一步Cox 回歸分析結果表明，miR-17 高表達、miR-490-3p 低表達是影響胃癌患者預后的危險因素，提示檢測癌組織miR-17、miR-490-3p 表達，可能有利于預測和評估患者預后。

此外，筆者分析，miR-17 與miR-490-3p 除可能通過調控胃癌細胞增殖、侵襲遷移參與胃癌病情惡化外，可能還與患者術后化療相關，如下調miR-17 表達增強口腔癌細胞對奧沙利鉑的化療敏感性[22]，miR-17 表達上調與提高套細胞淋巴瘤[23]、非小細胞肺癌等[24]腫瘤細胞放射抗拒相關，上調miR-490-3p 可降低耐藥蛋白表達及抑制P-gp 活性，逆轉乳腺癌細胞對阿霉素的耐藥性[25]。本研究未針對miR-17、miR-490-3p 表達與胃癌患者術后化療耐藥性的關系進行研究，后續將繼續探討miR-17、miR-490-3p 表達與患者術后放化療療效及耐藥性的關系，并探究miR-17、miR-490-3p 表達對患者術后化療方案選擇的指導作用。

綜上所述，本研究發現Hp 陽性胃癌患者癌組織miR-17 表達增加而miR-490-3p 表達降低，且均可能參與Hp 陽性胃癌細胞增殖、侵襲、遷移等過程；miR-17 高表達、miR-490-3p 低表達是影響Hp陽性胃癌患者預后的危險因素，均與患者不良預后有關，監測癌組織miR-17、miR-490-3p 表達可能有利于患者的預后判斷。但本研究未對血清樣本進行miR-17、miR-490-3p 表達的檢測，后續可做進一步研究。