液相色譜-質譜技術在核酸表觀遺傳修飾研究中的應用與展望

何唯唯，徐 華，瞿敏敏，張雅姣，徐 斌，謝劍煒

（軍事科學院軍事醫學研究院毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學國家重點實驗室，北京 100850）

核酸的表觀遺傳修飾可在不改變遺傳密碼或DNA序列的情況下，改變DNA或RNA的結構和生物化學性質，并通過發育、增殖過程將這種改變進行穩定遺傳，從而實現細胞與個體的多樣性。因此，核酸修飾與多種復雜生物過程有關，如細胞分化、基因組印跡和X染色體失活等。迄今已發現并鑒定了17種DNA修飾和至少160種RNA修飾［1-2］，其生物學功能的研究促進了表觀基因組學及表觀轉錄組學的發展［3］。“修飾組學”概念的提出，進一步闡明了DNA和RNA修飾與蛋白質修飾之間的緊密聯系，即核酸和組蛋白的表觀遺傳修飾對基因時空表達的DNA復制、轉錄、翻譯及翻譯后修飾4個階段進行調控，從而控制生成不同類型的細胞，最終體現為生物體的性狀和病理生理等差異［4］。因此，核酸修飾的鑒定越來越受到關注，已成為生命科學領域的研究熱點。

DNA甲基化作為最常見的核酸修飾類型，普遍存在于生物界各類物種，參與動態調控生理功能［5］，與人體正常生長發育密切相關的5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5-mC）和N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenine，6-mA）2種類型受到廣泛關注。5-mC主要以CpG二核苷酸的形式聚集在CpG島內，其功能性結果通常是造成長期、穩定的基因沉默，最終對基因表達、基因組印跡和X染色體失活等產生影響［6-8］。5-mC 可在 TET（ten-eleven translocation）雙加氧酶作用下逐步氧化為5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5-hmC）、5-醛基胞嘧啶（5-formylcytosine，5-foC）及5-羧基胞嘧啶（5-carbox-ylcytosine，5-caC）［9］，隨后通過堿基切除替換成正常的胞嘧啶，實現主動去甲基化。此過程廣泛發生，可對細胞生長、干細胞維持和胚胎發育產生影響［7］。6-mA最初發現于細菌基因組，與修復和基因表達調控等防御和生存過程密切相關。近年發現，6-mA也同樣存在于植物、脊椎動物和哺乳動物等真核基因組中，參與發育過程的基因表達調控，且差異分布于早期胚胎形成過程中，在AlkB家族的脂肪質量與肥胖相關蛋白（fat mass and obesity associated protein，FTO）、NMAD-1、DNA中6-mA 去甲基酶及烷基化修復同系物1（alkylation repair homolog 1，ALKBH1）等蛋白質的介導下，可發生與TET雙加氧酶的氧化去甲基化作用相似的過程，產生N6-羥甲基腺嘌呤（N6-hydroxymethyladenine，6-hmA）［10-14］。

然而，核酸修飾在體內的豐度通常非常低。例如，DNA中5-hmC和RNA中hm5C的比例可低至百萬分之一［11-12］。因此，特異性強、靈敏度高且具有良好選擇性的檢測方法是破譯這些修飾功能的關鍵。質譜具有良好的靈敏度和選擇性，已發展為最具潛力的核酸修飾分析技術，其中液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術可對目標物進行鑒定和定量分析，已被廣泛應用于核酸修飾研究中［15-22］。

目前已成功發展了多種基于LC-MS/MS的核酸修飾分析方法，主要基于電噴霧離子化（electrospray ionization，ESI）的負離子分析模式，結合多反應監測模式，以降低背景噪聲干擾，從而提高靈敏度和選擇性［13］。其基本策略通常為：將大分子核酸降解為核苷酸或堿基，經LC-MS/MS技術進行核酸修飾的鑒定和（或）定量。此外，還可通過匯總多種不同酶切方式的寡核苷酸結果獲得序列覆蓋率，實現序列中修飾的間接LC-MS/MS定位［16］。本文總結基于LC-MS/MS技術的核酸修飾分析的研究進展，并對其在生命科學和毒理學等領域的應用前景予以展望。

1 基于LC-MS/MS的核酸修飾分析方法

1.1 樣品預處理

在LC-MS/MS分析前，需首先進行一系列的樣品前處理，以減小生物樣品中大量存在的基質效應干擾。基于LC-MS/MS的核酸修飾檢測主要有2種分析策略：一種為以核苷作為目標物的準確定量分析；另一種則基于某段寡核苷酸序列，對其中的修飾位點進行識別和鑒定［18］。首先需明確所需的細胞或組織類型，對復雜組織進行物理分離及細胞分選，以獲得目標組織或細胞；然后從中提取并純化DNA或RNA，進而利用酸解或酶解法將核酸裂解，使其以堿基或核苷形式存在；最后再進入LC-MS/MS系統進行分離分析。

1.1.1 核酸水解產物的直接分析

LC-MS/MS常采用酸解或酶解法。酸解法主要獲得的分析單元為堿基，是將核酸分子直接在較高溫度、劇烈條件下與甲酸反應，使堿基直接解離下來，再用質譜檢測其中5-mC和5-hmC等類型的響應強度，并計算全基因組、單細胞等范圍內甲基化程度［19-21］。若在酸解前結合亞硫酸氫鈉還原法及聚合酶鏈式反應擴增過程，則可通過LC-MS/MS對擴增產物實現特定區域DNA甲基化程度的定量分析［22］。

相較于酸解法，酶解法的反應條件相對溫和，屬于“逐級”降解。對于雙鏈DNA，首先進行解旋，再將解旋后的單鏈DNA酶解成單核苷酸，此后再對單核苷酸的磷酸基團進一步酶解，最終以核苷形式進行色譜分離和質譜檢測，進而計算核苷酸修飾程度及比例。核酸酶解中常用的酶主要有脫氧核糖核酸酶Ⅰ［23-24］、核酸酶P1［25-26］、磷酸二酯酶［27-28］、堿性磷酸酶［29］以及適用于多種結構核酸的全能核酸酶［30-31］等（表1）。

表1 核酸酶解中常用的酶

近年來發展了多種基于酶解法的核酸修飾分析新方法。2020年，針對DNA酶解緩沖液、共洗脫殘留以及未修飾核苷酸抑制待測修飾核苷酸的質子化問題，汪海林課題組建立超高效LC-MS/MS（ultra performance LC-MS/MS，UPLC-MS/MS）方法，利用碳酸氫銨作為流動相添加劑，提高氣相中的質子化能力，促進質子轉移到目標核苷酸上，以同時消除這些干擾，實現了DNA中胞嘧啶修飾（5-mC，5-hmC，5-foC和5-caC）的無質子化抑制和靈敏定量檢測［32］。

袁必鋒課題組基于限制性酶切-體積排阻超濾體系，去除了真核生物細胞組織中來自細菌等原核生物核酸修飾的干擾［10，33］；繼而建立了基于熒光素標記及生物素-親和素反應的磁珠捕獲方法，對外周血循環腫瘤細胞進行富集、裂解和酶解，發現其中同時存在DNA低甲基化及RNA高甲基化現象［34］。該課題組用中性酶、溫和條件進行酶解后，對RNA中的多種修飾進行檢測，首次在哺乳動物RNA中檢測出2-羥甲基鳥嘌呤（2-hydroxymethylguanine，hm2G）修飾類型［35］。此方法體系的建立將甲基化定量擴展到單細胞水平，但目前發現的限制酶主要針對DNA甲基化（5-mC和6-mA）及其氧化衍生物（5-hmC），其他修飾類型較少，主要原因是單一的限制性內切酶只能對特定序列進行識別，故酶切法對序列的特異性要求較高，這使其實際應用受到一定限制。

1.1.2 核酸修飾的化學衍生-質譜分析

盡管LC-MS/MS等對大多數核酸修飾的檢測靈敏度較高，但對于微量樣品的核酸修飾分析，或一些體內豐度極低的核酸修飾類型的檢測，直接分析法的靈敏度仍無法滿足其要求。化學衍生及標記法通過在水解獲得的核苷酸產物上共價鍵合衍生化基團，以改變分析物的理化性質，從而提高色譜分離效果和ESI的離子化效率［36］，最終提高LCESI-MS的檢測靈敏度［37-40］。以下根據衍生化試劑的特征基團及反應類型進行分類，總結化學衍生-質譜技術的核酸修飾分析方法研究進展（表2）。

存在于DNA和RNA上的胞嘧啶修飾豐度差別較大，不易直接進行同時定量檢測。袁必鋒課題組利用溴乙酰基與胞嘧啶上N3和N4位形成穩定五元環的反應，實現了對DNA和RNA上甲基化胞嘧啶及其氧化去甲基化產物的同步和高靈敏檢測［41］。此后，又根據此類衍生化反應對RNA中的雙甲基胞嘧啶修飾及其氧化產物，即2′-O-甲基-5-甲基胞嘧啶（2′-O-methyl-5-methylcytidine，m5Cm）、2′-O-甲基-5-羥甲基胞嘧啶（2′-O-methyl-5-hydroxymethylcytidine，hm5Cm）、2′-O-甲基-5-醛基胞嘧啶（2′-O-methyl 5-formylcytidine，fo5Cm）和2′-O-甲基-5-羧基胞嘧啶（2′-O-methyl-5-carboxylcytidine，ca5Cm）進行了衍生化檢測，發現這4種胞嘧啶修飾主要存在于＜200 bp的小RNA中，且m5Cm會在ALKBH1蛋白作用下氧化成hm5Cm和fo5Cm，可能與DNA和RNA發生的TET雙加氧酶介導5-mC主動去甲基化機制類似［42］。

基于嘧啶類堿基N3這一活性位點，該課題組最近又開發了新的衍生化方法，利用N-環己基-N′-β-（4-甲基嗎啉鎓）乙基碳二亞胺對甲苯磺酸鹽〔N-cyclohexyl-N′-β-（4-methylmorpholinium）ethylcarbodiimide p-toluenesulfonate〕中的碳化二亞胺基團與尿嘧啶上N3位亞氨基的反應，提高了反相色譜的分離效率及ESI離子化效率，首次在哺乳動物mRNA中發現了5-甲基尿嘧啶（5-methyluridine，m5U）這一修飾類型，并通過穩定同位素細胞代謝示蹤發現其中甲基來源于S-腺苷-L-甲硫氨酸［43］。

對于5-foC和5-caC等核酸修飾，也可采用羰基類衍生化反應提高LC-MS檢測靈敏。該課題組利用酰肼和胺等與羰基縮合形成腙的衍生化反應開發了一種氧化衍生化聯合質譜方法（oxidationderivatization combined with MS，ODMS），將RNA中hm5C用MnO2氧化成fo5C，然后與丹磺酰肼反應，產生易帶電的叔胺腙衍生物，顯著提高了LC-MS中fo5C的離子化效率［44］。基于同類成腙反應，該課題組又建立了一種管內固相微萃取與吉拉德P試劑（Girard P，GirP）衍生化相結合的分析策略，利用帶負電的羧基填料對帶正電荷的衍生化產物進行富集，消除了未修飾核苷的干擾，實現了對來自哺乳動物DNA和RNA中6種醛基化修飾核苷，即DNA中的5-foC及RNA中的fo5C、5-醛基尿嘧啶（5-formyluracil，fo5U）、fo5Cm 和 2′-O-甲基-5-醛基尿嘧啶（2′-O-methyl-5-formyluridine，fo5Um）的同步檢測［45］。

張新祥課題組基于5-foC到5-caC的主動氧化反應，用含有疏水性三嗪基和2個易帶電的叔胺基肼類試劑i-Pr2N與DNA上5-foC的羰基氧及5-caC羧基氧進行快速、同時衍生化反應，實現了超靈敏LC-ESI-MS/MS檢測［46］。此外，Zhou等［47］使用氰基磷葉立德試劑（YC-CN）與DNA中5-foC上醛基的Wittig反應，在5-foC上構建了一個高特異性熒光開關，引入光輔助三重“多米諾”反應，實現了5-foC的高靈敏、快速檢測，并從反應機制角度實現了5-foC和5-foU的區分。

近年來，化學衍生LC-MS/MS研究也針對磷酸、戊糖上的修飾位點開發了系列衍生化質譜檢測新方法。袁必鋒課題組分別以N，N-二甲基對苯二胺和8-（重氮甲基）喹啉為衍生化試劑，利用胺及重氮基與磷酸上羥基發生的縮合反應，實現了5-甲基-2′-脫氧單磷酸胞苷和5-甲基-單磷酸胞苷等10種單磷酸核苷及哺乳動物組織和細胞中12種內源性三磷酸核苷的高靈敏檢測。這些對核苷以外形式的修飾研究證明了游離態修飾核苷酸的普遍存在，其可能在DNA復制和轉錄過程摻入核酸［48-49］。此外，該課題組利用金屬氧化物CeO2的高親和性和特異性，對復雜生物樣品中攜帶順式二羥基的核糖綴合物進行選擇性捕獲。在此基礎上，用丙酮和丙酮-d6上的醛基與富集核苷上的羥基縮合，然后對丙酮和丙酮-d6衍生化產物在相同條件下電離，進行MS檢測，顯著提高了檢測特異性，鑒定出人尿液中49種RNA上的核糖綴合物，其中7種含量在健康對照組和淋巴癌患者間具有顯著差異［50-52］。此外，蔡宗葦課題組使用類似策略，將尿液樣本中可鑒定的修飾核苷增加到52種［53］。

總之，化學衍生化法是一種有效的前處理方法，可顯著改善低豐度核酸修飾分析的靈敏度和特異性，實現特異且高效的定量及測序應用，且有助于新類型核酸修飾的發現，以及疾病、表觀遺傳毒理學相關機制研究的探索。但當前的衍生化方法尚未解決過量衍生化試劑及副產物生成的干擾，仍需開發更有效的化學衍生化策略。

1.2 基于質譜的核酸修飾位點鑒定

表觀遺傳修飾的位點序列信息是了解其生物學功能的基礎。修飾核苷的鑒定及準確定量檢測可從整體角度獲得基因組DNA及多種類型RNA中的修飾存在性及比例，但此種方法并不能得知修飾在某段序列中的位置。因此，需借助其他手段，在核苷酸序列水平對修飾進行定位。基于質譜技術的核酸序列分析具有所需樣品量少、準確性高、可同時分析多種類型核酸修飾的優勢，適用于寡核苷酸序列中核酸修飾的準確定位；結合免疫共沉淀、限制性內切酶酶切法、逆轉錄測序、化學標記/轉化法、納米孔單分子測序和冷凍電子顯微鏡等技術，可實現全基因組和轉錄組水平中核酸修飾的破譯，從而更加精準地揭示其表觀遺傳學功能［54］。

基于LC-MS/MS的序列分析對象通常為較短的RNA（如rRNA和tRNA等），或采用特異性核酸酶處理，以獲得適宜LC-MS/MS分析的寡核苷酸片段，然后通過產物離子磷酸二酯鍵中P-O鍵的特征性裂解獲得階梯序列，拼接成含有修飾位點的寡核苷酸前體離子［55-56］。最常使用的RNA水解酶為RNA酶T1和RNA酶A，其中，RNA酶T1的斷裂位點為鳥嘌呤，RNA酶A的斷裂位點則為嘧啶類堿基［57-58］。結合使用多種RNA酶產生獨特、互補的酶解產物，從而重構成完整的、涵蓋修飾位點的寡核苷酸序列，獲得最大的序列覆蓋度［59］。因此，開發新類型的堿基特異性核酸酶是實現完整序列覆蓋的關鍵。Addepalli課題組近年開發了多種新型RNA酶，包括RNA酶U2、RNA酶MC1和RNA酶cusativin，其識別的堿基分別為未修飾的腺嘌呤、尿嘧啶和胞嘧啶［60-62］。基于這種“自下而上”的LCMS/MS序列分析方法，已獲得了真核及原核生物RNA中多個修飾位點，包括大腸桿菌（Escherichia coli）23 S rRNA中的3-甲基假尿嘧啶（3-methyl pseudouridine，m3Ψ）、mRNA中的m5U和Ψ，利什曼原蟲（Leishmania tarentolae）線粒體tRNA中的2-巰基尿嘧啶（2-thiouridine，s2U），以及在枯草桿菌、植物及錐蟲tRNA中均檢測到的37位ms2ct6A（2-methylthio cyclic N6-threonylcarbamoyladenosine）［63-65］。此外，Rahimoff等［66］通過設計、合成探針，結合LC-MS/MS對脫堿基位點（abasic sites）及其中間產物β-消除位點產物進行定量，結合同位素標記核苷酸，可將中間產物溯源為最初的堿基形式。此種方法為序列中堿基切除修復的定位和定量分析提供了新思路。

相較于LC-MS/MS，“自上而下”MS法的優勢在于無需進行酶解，可直接對完整核酸序列進行分析。目前已實現對植物miRNA末端2′-O-甲基化的鑒別［67］。此外，可對大腸桿菌tRNA中多種修飾進行定位，并獲得tRNA的碰撞誘導解離譜圖，序列覆蓋度可達89%［68］。最近，“自上而下”MS 法又應用于RNA中多種修飾混合物（m6A，m5C，m3U和m5U）的分析中，揭示了其在異構化修飾鑒別中的作用［69］。然而，此方法對核酸樣品的純度要求很高，當前僅可用于RNA純品的分析中，有待與生物樣品處理新方法的結合應用。與穩定同位素修飾相結合，LC-MS/MS方法已應用于揭示修飾堿基的代謝途徑及其在基因組、轉錄組中的狀態，但缺陷在于僅能追溯特定結構核酸修飾，無法準確提供大規模的核酸序列信息。因此，當混入外源DNA等污染物時，會使其無法與相關基因組中的核苷區分，這種情況需要謹慎規避［14，43，70-71］。

基于質譜的測序技術可以應用于寡核苷酸序列中修飾位點的鑒定及同分異構體的區分。此外，也可在全基因組、轉錄組范圍水平上，結合現有的多種高通量測序方法對修飾核苷酸進行定位。通過免疫共沉淀技術可對低豐度的核酸修飾進行富集，但該方法尚無法進行單堿基水平的定位，且需要特異性識別目標物的抗體［72］。化學反應介導的測序彌補了這一缺陷，可實現單堿基水平的全基因組修飾核苷酸定位，其中最經典的亞硫酸氫鹽轉化法可實現全基因組DNA甲基化的單堿基分辨分析。近年也應用于果蠅rRNA和tRNA及人mRNA中m5C的分析中［73-74］。但該方法必須基于高選擇性的化學反應，且需不斷進行條件優化，以避免核酸，特別是RNA的降解，這是當前的難點所在。

相較于化學反應介導測序，酶介導的測序方法處理條件溫和，可進行直接分析，避免了大量核酸的降解。袁必鋒課題組建立了AMD-seq測序法，利用胞嘧啶及其修飾在重組APOBEC3A酶結合作用下發生脫氨基反應，使胞嘧啶（C）轉化為尿嘧啶（U）、5-mC轉化為胸腺嘧啶（T），結合β-GT糖基化5-hmC（5-ghmC）的脫氨基抵抗作用，使處理后測序中C、5-mC讀成“T”，5-hmC讀成“C”，從而實現了DNA中5-hmC的單堿基分辨率分析［75］。目前適宜進行酶介導測序分析的核苷酸修飾種類并不多，但這種方法仍具有很大的應用潛力。當前主要的核酸序列分析方法比較見表3。

表3 核酸測序分析方法比較

2 LC-MS/MS技術在核酸表觀遺傳修飾研究中的應用

2.1 DNA甲基化及其氧化衍生物在基因組中的定位研究

研究表明，多種毒物誘發的疾病及人類癌癥的發生均與TET雙加氧酶的異常活性相關。Pfaffeneder等［70］以小鼠胚胎干細胞為模型，通過穩定同位素示蹤結合定量質譜法研究發現，TET雙加氧酶的氧化作用不僅局限于胞嘧啶，還可催化胸腺嘧啶氧化為5-羥甲基尿嘧啶（5-hydroxymethyluridine，5-hmU）。結合穩定同位素示蹤及肽示蹤的蛋白質相互作用實驗進一步證明，TET雙加氧酶的氧化作用與DNA的有效修復密切相關。DNA中嘧啶類和嘌呤類堿基上的甲基化修飾及其相關氧化關系如圖1和圖2所示。通過對哺乳動物DNA胞嘧啶的UPLC-MS檢測，Bachman等［76］證實了5-hmC的體內穩定性，證明其本身也是一種表觀遺傳標記。上述結果均表明，DNA甲基化的動態、可逆調節機制在生物體內具有重要作用，5-mC及其氧化產物可作為環境毒物暴露的效應標志物及癌癥預測和診斷的標志物。

圖1 哺乳動物基因組中存在的DNA嘧啶類修飾及其轉化關系.dC：脫氧胞苷；dT：脫氧胸苷；dU：脫氧尿苷；DNMT：DNA甲基轉移酶；ROS：活性氧；TDG：胸腺嘧啶DNA糖基化酶；BER：堿基切除修復；5-hmdC：5-羥甲基脫氧胞苷；5-fodC：5-醛基脫氧胞苷；5-cadC：5-羧基脫氧胞苷；5-mdU：5-甲基脫氧尿苷；5-hmdU：5-羥甲基脫氧尿苷；5-fodU：5-醛基脫氧尿苷；5-cadU：5-羧基脫氧尿苷.

圖2 哺乳動物基因組中存在的DNA嘌呤類修飾及其轉化關系.dA：脫氧腺苷；dG：脫氧鳥苷；6-mdA：N6-甲基脫氧腺苷；5-mdC：5-甲基脫氧胞苷；6-hmdA：N6-羥甲基脫氧腺苷；6-fodA：N6-醛基脫氧腺苷；8-oxodG：8-氧代脫氧鳥苷；8-OH-dG：8-羥基脫氧鳥苷；8-oxoG：8-氧代鳥苷；8-OH-G：8-羥基鳥苷.

近年測序類研究結果顯示，m5C在RNA中同樣廣泛存在，可鑒定出8000余個位點，并大量集中于非編碼區及結合區域［77］，其氧化產物以hm5C為主，fo5C及ca5C含量極低［39，78-79］。此外，Xu等［80］和Ma等［81］近年在哺乳動物及人mRNA中發現，在類甲基轉移酶-8（methyltransferase-like 8）催化作用下形成的3-甲基胞嘧啶（m3C），可在鏈內引入1個單位正電荷，導致RNA二級結構的變化，進而影響其與蛋白質的相互作用。

Schiffers等［14］近年提出了關于小鼠胚胎干細胞及基因組中6-mA存在性的質疑。針對這一問題，汪海林課題組建立了無污染UPLC-MS/MS方法，并通過酶解法完全釋放6-mA，從而對哺乳動物細胞系DNA中6-mA進行超靈敏、精確定量檢測，確證了6-mA在真核細胞中的存在性，且發現DNA中6-mA依賴于DNA聚合酶［82］。盡管不斷有研究揭示6-mA存在于真核生物DNA中，但囿于其較低的體內豐度，具體功能機制仍尚未闡明，甚至在近年關于6-mA與腫瘤發生相關的研究中獲得了相反的結果［13，83］，這說明仍需不斷發展高靈敏檢測技術，以證實其在真核生物DNA中的水平，并進一步研究其在生長發育過程中的功能。

2.2 多種新類型RNA修飾的發現和鑒定

m6A也是真核生物RNA中含量最豐富的修飾類型。近年研究表明，與m6A修飾過程相關的去甲基化酶ALKBH5可促進mRNA的出核轉運過程，而降低m6A甲基化酶復合物METTL3的表達則會減緩mRNA從細胞核到細胞質的轉運［84-85］。此外，與DNA中的6-mA修飾相同，FTO同樣能介導RNA上m6A的連續氧化去甲基化過程，相繼生成hm6A和N6-醛基腺嘌呤（N6-formyladenine，fo6A）［86-87］，表明mRNA上腺嘌呤甲基化也是動態的生理調控過程［5］。

m7G進化相對保守，通常存在于真核生物mRNA的5′帽子處，與前體mRNA的有效剪接、多聚腺苷酸化、出核運動及翻譯等過程密切相關［88-89］。2018年，袁必鋒課題組研究發現，m7G同樣存在于其內部片段中，且在重金屬暴露下mRNA中5′端、內部m7G的含量均會顯著下調，揭示其作為環境毒物暴露效應標志物的潛能［90］。此外，m7G攜帶正電荷，可通過影響tRNA中堿基配對而改變其高級結構［91］。

Ψ普遍存在于RNA中，可增加tRNA和rRNA的穩定性。近年LC-MS/MS檢測發現，Ψ同樣存在于哺乳動物mRNA中，且經修飾Ψ/U比率為0.2%～0.6%，與m6A含量相當，可能具有增加遺傳密碼多樣性、翻譯調控的功能，并與mRNA的穩定性及定位相關［92-94］。此外，存在于rRNA上的Ψ修飾還可改變核糖體對mRNA的親和力，從而影響特定mRNA的翻譯起始過程［95］。

在所有類型RNA中，tRNA上的修飾密度最高、類型最多。其中，二氫尿嘧啶與Ψ和m1A等簡單修飾普遍存在于所有類型的tRNA中，但其他較高級修飾則具有區域特異性，可視作一種進化的標志［96］。tRNA修飾是蛋白質合成的重要調控元件，細胞利用反密碼子環及周圍的tRNA修飾對有限合成的蛋白質類型進行選擇性改變，進而通過影響密碼子與反密碼子間的親和力，實現tRNA修飾對翻譯過程的速度、精準度進行調控，以避免反密碼子環松散或塌陷，造成移碼錯誤［97］。

rRNA修飾參與RNA和蛋白質等生物大分子與多種小分子配體的相互作用，故具有相對保守的空間分布，集中在解碼、tRNA結合位點、肽基轉移酶中心及rRNA亞基界面等重要功能區域，故也參與核糖體功能調節，并可精細調節核糖體活性［98-99］。目前已在大腸桿菌中鑒定出36種修飾核苷［4］，真核rRNA上也鑒定出多個以2′-O-甲基化和Ψ為主要類型的多個修飾位點。例如，釀酒酵母rRNA中有55個2′-O-甲基化修飾位點和44個Ψ修飾位點。人rRNA中存在的200多個位點中，半數以上為2′-O-甲基化和Ψ［100］。2種修飾均可穩定RNA二級和三級結構，2′-O-甲基化修飾可增強堿基堆積力，從而起到穩定堿基對的作用［101］。目前已確定的核酸修飾功能見表4。

總之，轉錄組中的修飾核苷酸可影響RNA的結構，從而改變其與蛋白質間的親和力，最終調控基因表達，使RNA-蛋白質相互作用網絡多樣化、復雜化。近年研究逐漸指向模板mRNA中修飾核苷酸對密碼子的影響，最終體現在對翻譯表達蛋白質的序列和高級結構的干擾［102］。由此表明，可基于“中心法則”這一主線，建立應用于修飾組學中的核酸修飾、蛋白質表達的LC-MS/MS新方法。

2.3 核酸修飾定量技術在表觀遺傳毒性研究中的應用

環境中有毒有害物質的暴露可誘發人體的多種生物代謝過程，如炎癥、氧化應激、脂質過氧化、感染和腸道菌群轉移等，從而在這些過程中生成異常代謝產物，并不斷蓄積突變，控制細胞增殖、分化和凋亡過程，最終影響人類健康，誘發多種疾病。基于環境污染物致癌效應、神經退行性疾病等多重研究證據表明，多種退行性疾病的形成與生命體早期接觸或暴露于環境污染物有關，可能是意外性接觸或長期、低劑量職業性暴露的遲發作用后果。表觀遺傳學從基因的轉錄及轉錄后調控水平解釋了機體接觸或暴露污染環境后形成相對穩定特征性印跡的原因，也為化合物誘導的長期、跨代毒性效應的毒理機制研究提供了證據和新的視角。

當前研究已證實，外源性毒物接觸可使機體形成穩定的表觀遺傳圖譜，且具有毒物暴露特征性，可作為有效的暴露標志物。基于外源化學物暴露造成的機體表觀遺傳效應已逐漸發展為表觀遺傳毒理學這一新興研究領域。目前已明確了幾類具有表觀遺傳效應的毒性因子，包括金屬、過氧化物酶體增殖物、空氣污染物、內分泌干擾物等環境來源的化學物、飲食和生活習慣等個體差異性因素，也包括意外性接觸或蓄意實施的新型、大規模殺傷性化學和生物武器［103］。關注外源化學物引起的表觀遺傳學變化及其可能產生的健康危害效應并針對特定從業人員的職業性暴露導致的表觀遺傳毒性機制研究，不僅對于人類風險評定、風險因子及相關材料接觸的識別具有重要意義，也為潛在、新型核化生威脅的預警偵查提供了新的可能性［104］。理論上，表觀特征標志物（episignatures）是機體暴露于復雜環境的“適應性重塑”，可實時反映機體中特定組織的健康狀態，從而預判疾病的發生情況。通過比較環境化學物暴露后分子水平、細胞水平、組織水平及人群中的表觀基因組輪廓，獲得環境化學物的潛在表觀遺傳毒性效應，結合采用系統毒理學方法，可實現基于表觀基因組輪廓的環境毒物篩選與早期預警，獲得更完整的人類表觀毒理學輪廓信息，形成改進后的高通量篩選策略［103］。

基于MS的分析可實現核酸修飾的整體水平準確定量，結合高通量測序技術，可在表觀基因組及表觀轉錄組水平獲得不同類型環境毒物暴露的特征性輪廓，為相關的表觀遺傳毒理機制研究提供重要依據。隨著單分子實時檢測（single-molecule realtime detection）、納米孔測序等第三代測序技術的發展，可獲得更加全面、準確的核酸修飾變化圖譜，以進一步揭示毒物的跨代、遠期毒性效應，并從毒物誘導的表觀遺傳效應角度揭示毒物的“三致作用”（即致癌、致畸、致突變）分子機制［105-106］。此外，借助基于高分辨質譜（high-resolution mass spectrometry）技術的“暴露組學”平臺，可實現多種環境因素暴露后體內的外源化合物轉化形式及內源性代謝產物的高通量、高靈敏監測；結合生物信息學數據挖掘技術的差異表達性分析，可模擬職業性接觸、工業性接觸、食品源接觸等真實情況下機體暴露于復雜環境后的體內代謝，并通過核酸修飾，從表觀遺傳角度解釋多重環境因素在體內的復雜累加效應［40，107］。

然而，表觀遺傳毒理學研究尚處于起步階段，相關毒性分子機制研究及模型的驗證方法尚不完善，尚未全面開展在人體水平的風險因子暴露類型和水平預警的具體應用［108］，其主要局限在于不同年齡、不同性別和不同生活習慣的群體及同一機體內所有組織和細胞類型的表觀遺傳印跡鮮有共性。尚未獲得適宜作為對照組的表觀基因組和表觀轉錄組輪廓規律，無法建立適用于所有人群和不同類型樣本統計學模型的統一標準。此外，當前的表觀遺傳效應多基于臨床疾病的預后性研究，無法排除年齡、性別、個人生活習慣及自身健康狀況等因素的影響，尚未實現將特征性的表觀遺傳效應直接與機體暴露的風險因子相關聯。因此，如何將毒物暴露的細胞和動物模型外推至人體也是當前表觀遺傳風險預警應用面臨的重要挑戰。

3 結語和展望

近年關于新類型核酸修飾的定量及定位的研究極大促進了表觀基因組學及表觀轉錄組學的發展，高靈敏度、低成本的質譜分析技術已成為極低豐度核酸修飾研究的最佳研究手段之一，基于LCMS/MS技術的核酸修飾方法具有良好的實際應用性，已成為分析化學與生命科學、環境毒理學和藥學的交叉研究熱點。隨著基因組學和轉錄組學研究的深入，小RNA和長鏈非編碼RNA等特殊類型RNA逐漸成為近年的研究熱點，但對其中的特殊核酸修飾類型及其對調控功能影響尚不夠明確，需要新技術和新方法的進一步推動。

核酸修飾研究前景很大程度依賴于質譜技術的發展和進一步應用。首先，仍需改進核酸修飾的檢測和分析技術，建立并優化核酸的在線酶解等高效樣品前處理技術，以去除外源修飾核苷酸對目標物的干擾，并從核酸修飾的化學衍生化、特異性抗體捕獲等角度發展靈敏度、選擇性更佳的分析策略，改善當前測序技術中的假陽性現象。這些新技術的發展有助于核酸序列中修飾位點的準確識別和新類型核酸修飾的發現，有望作為毒理學研究中新的標志物，也可為蛋白質組學和代謝組學生命機制的研究提供新的線索。此外，亟需通過分析化學、生命科學、毒理學和生物信息學等學科交叉，發展基于質譜、高通量測序及計算表觀遺傳學的高靈敏度、高通量串聯檢測平臺，更好地實現“表觀修飾”這一穩定印跡在疾病診斷、風險評估和預警中的應用。