幼齡1型糖尿病模型小鼠脂肪來源干細胞的鑒定及其成脂分化能力

張金霞，劉偉江，蘇菲婭，張 晗，于豐實，白海濤，袁福臨，劉元林，李 雪，王 洋，鄭榮秀，張 毅

（1.天津醫科大學總醫院兒科，天津 300052；2.軍事科學院軍事醫學研究院輻射醫學研究所，北京 100850）

1型糖尿病（type 1 diabetes mellitus，T1DM）是由胰島β細胞被免疫性破壞導致胰島素分泌不足引起的一種高血糖及糖代謝異常的免疫性疾病［1］。根據國際糖尿病聯合會的最新研究報告指出，患有T1DM的兒童和青少年（0～19歲）已達110萬，成為威脅世界各國兒童健康的新問題［2］。目前，T1DM仍以注射外源性胰島素替代療法為主，并不能阻止和修復破壞的胰島細胞［3-4］，迫切需要研發新的治療方法。因此，修復和再生胰島細胞成為治療的關鍵。

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）是一類能夠自我更新并可分化為多種功能細胞的成體干細胞，可從多種組織中獲得，包括骨髓、脂肪組織和臍帶等［5-6］。MSC具有免疫調節特性和再生胰島素細胞的能力，對糖尿病患者展現出良好的治療潛力［7］。在動物實驗和臨床試驗中，靜脈注射同種異體臍帶或骨髓來源的MSC，可有效改善胰腺β細胞的功能，有些患者可出現短期的血糖正常、脫離胰島素治療的現象［8-12］。由于脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSC）具有易獲取、來源豐富、低免疫原性及免疫調節等生物學特性和作用成為MSC臨床應用的理想種子細胞［13-15］。T1DM患者糖代謝異常導致明顯的消瘦，體重減輕；自身免疫反應導致抗炎因子增多，體內微環境改變。而ADSC作為脂肪組織微環境的主要細胞成分之一，在維持細胞環境穩態和調控脂肪前體細胞分化和成熟過程中發揮重要作用。因此推測，ADSC可能影響T1DM的發展及脂肪形成，但尚未見相關研究報道。本研究制備幼齡T1DM小鼠模型，觀察其ADSC的成脂和成骨分化能力，為揭示T1DM患者消瘦的原因及闡明T1DM發病機制提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

20只3周齡雄性 C57BL/6J小鼠，體重9.5～10.5 g，北京斯貝福實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK-（京）2019-0010，飼養于軍事醫學研究院實驗動物中心，12 h晝夜交替，環境溫度22～25℃，相對濕度為35%～50%。所有動物實驗過程均經軍事醫學研究院實驗動物倫理委員會批準。

1.2 試劑和主要儀器

鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）、油紅O、地塞米松、胰島素、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、吲哚美辛、維生素C磷酸鹽、β-磷酸甘油和堿性磷酸酶，美國Sigma公司；Ⅱ型膠原酶、丙酮酸、檸檬酸、檸檬酸三鈉和4%多聚甲醛，國藥集團化學試劑有限公司；α-MEM、0.25%胰酶、PBS緩沖液、胎牛血清和Trizol試劑，美國Gibco公司；兔抗小鼠胰島素單抗，美國Abcam公司；流式抗體〔FITC標記抗小鼠CD11b，Sca-1，CD34和CD45抗體；PE標記抗小鼠CD90、主要組織相容性復合體Ⅱ（major histocompatibility complex Ⅱ，MHCⅡ）、CD31和CD29抗體〕，美國ThermoFisher公司；RTase M-MLV、RNA酶抑制劑及5×RTase M-MLV緩沖液，日本TaKaRa公司；DTT、dNTP、無RNA酶水和2×Mltra Master Mix，中國康為世紀有限公司；實時熒光定量PCR（RT-PCR）引物由上海生工生物有限公司合成（表1）。穩擇易型血糖儀和穩擇易型血糖試紙，美國強生公司；低溫冷凍離心機、Qubit?2.0熒光定量儀和7500實時熒光定量PCR儀，美國 Thermo Fisher公司；流式細胞儀Facscalibur，美國BD公司；倒置相差顯微鏡和正置顯微鏡，日本Nikon公司。

Tab.1 RT-PCR primer sequences

1.3 幼齡T1DM小鼠模型的制備和鑒定

取20只SPF級3周齡C57BL/6J雄性小鼠，適應性喂養3 d。隨機分為T1DM模型組和正常對照組，每組10只。T1DM模型組連續5 d ip給予STZ 50 mg·kg-1，7 d后連續3 d尾靜脈取血，檢測空腹隨機血糖，以隨機血糖均值≥16.7 mmol·L-1為建模成功。正常對照組ip給予等體積檸檬酸緩沖液。造模成功后14，21和28 d分別檢測空腹隨機血糖和體重變化，14 d后取胰腺組織進行石蠟切片，固定后進行HE染色顯微鏡下觀察胰腺組織的病理改變。免疫組織化學法檢測胰腺組織胰島素水平，胰島素水平用陽性染色積分吸光度值表示。

1.4 幼齡T1DM模型小鼠ADSC的分離和培養

建模成功14 d后，脫頸處死正常對照組和T1DM模型組小鼠，無菌條件下取腹股溝和性腺周圍的脂肪組織，膠原酶消化法制備ADSC，用α-MEM培養基37℃，5%CO2孵育。每2～3 d換液，直至細胞匯合達80%～90%時傳代。

1.5 細胞形態觀察和細胞表面標志物測定

將T1DM模型組和正常對照組小鼠ADSC原代培養至第2～5天，倒置顯微鏡觀察細胞形態；培養至第3代（P3代）時，倒置顯微鏡和Giemsa染色觀察細胞生長狀態。

選用P3代細胞用流式細胞術檢測細胞表面標志物。所用流式抗體為FITC-抗小鼠CD11b、PE-抗小鼠 CD31、FITC-抗小鼠CD34、PE-抗小鼠CD29、FITC-抗小鼠CD45、PE-抗小鼠MHCⅡ、FITC-抗小鼠Sca-1和PE-抗小鼠CD90單抗，抗體稀釋比和操作步驟同抗體說明書。

1.6 體外誘導成骨分化能力的測定

選來源于T1DM模型組和正常對照組小鼠P3代ADSC，胰酶消化、離心后，以每孔3×104細胞密度接種于6孔板，設自分化（未誘導）組和成骨誘導分化組。待細胞貼壁24 h后，成骨誘導分化組更換為成骨誘導液。成骨誘導分化體系為β-磷酸甘油10 mmol·L-1、地塞米松 0.1 μmol·L-1和維生素 C 磷酸鹽50 μmol·L-1，誘導7～14 d。誘導7 d后堿性磷酸酶染色，PBS清洗后丙酮固定，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌終止顯色反應。藍紫色增加表明堿性磷酸酶活性增強，ADSC成骨分化能力增強。實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測成骨分化關鍵轉錄因子Ost和Runx2 mRNA表達。

1.7 體外誘導成脂分化能力的測定

選來源于T1DM模型組和正常對照組小鼠P3代ADSC，胰酶消化、離心后，接種于6孔板，自分化（未誘導）組和成脂誘導分化組分別以每孔2×104和1×105細胞密度接種于6孔板內。24 h細胞貼壁后，成脂誘導分化組更換為成脂誘導液。成脂誘導分化體系為吲哚美辛0.5 mmol·L-1、胰島素10 μg·L-1、地塞米松1 μmol·L-1和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤0.5 mmol·L-1。誘導9 d后，多聚甲醛固定，油紅O染色，顯微鏡觀察細胞內脂滴數量。RT-PCR檢測成脂分化關鍵轉錄因子CEBPα和PPARγ mRNA表達。

對公共圖書館招聘信息中的其他需求進行詞頻可視化的結果顯示，公共圖書館的其他招聘要求主要集中于考核方式和限制條件（見圖5）。由于公共圖書館的招聘面向群體更廣，自主權更大，因此一些省份對應屆生和社會人員的招聘分開進行，沿海省份如廣東、上海、福建、遼寧、天津等地對于非應屆生有戶籍限制。公共圖書館更青睞職稱較高的館員，對具有中級和副高級職稱的非應屆生實行優先錄取政策，說明公共圖書館更加注重應聘者的工作經驗。

1.8 RT-PCR檢測成骨和成脂分化相關基因mRNA表達

Trizol法提取各組細胞的總mRNA，取1 μg定量逆轉錄生成 cDNA，RT-PCR檢測CEBPα和PPARγ及Ost和Runx2 mRNA表達。反應體系：cDNA 1 μL，PCR 上下游引物（10 μmol·L-1）1 μL，RT-PCR Master Mix 10 μL和無RNA酶水8 μL；反應條件：95℃ 10 min，（95℃ 15 s，60℃ 1 min）40個循環，95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃15 s。GAPDH為內參基因，采用2-△Ct表示待測基因mRNA表達水平。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 幼齡T1DM小鼠模型的鑒定

圖1結果顯示，與正常對照組相比，T1DM模型組小鼠出現明顯的多飲、多尿、多食等癥狀，外觀毛發暗淡無光澤，體型消瘦（圖1A），且體重增長顯著低于正常對照組（P＜0.05，圖1B）；血糖水平顯著高于正常對照組（P＜0.05，圖1C），隨機血糖≥16.7 mmol·L-1。表明幼齡T1DM小鼠模型制備成功。

Fig.1 General physiological status（A），body mass（B）and blood glucose concentration（C）of streptozotocin（STZ）-induced young type 1 diabetes mellitus（T1DM）model mice.T1DM model was induced in three-week-old male C57BL/6 mice using STZ 50 mg·kg-1ip via tail vein for 5 d，and body mass and blood glucose were tested at 14，21 and 28 d，respectively.±s，n=10.＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.2 幼齡T1DM模型小鼠胰腺組織病理改變

HE染色結果（圖2A1）表明，正常對照組胰島組織結構完整；T1DM模型組胰島組織結構基本被破壞，依稀可見形態不規則的殘存結構，胰島面積顯著小于正常對照組（P＜0.01）（圖2A2）。免疫組織化學法檢測結果（圖2B1）顯示，T1DM模型組胰島組織結構破壞嚴重，胰島素免疫陽性反應較正常對照組降低，表明胰島素分泌明顯減少（P＜0.01）（圖2B2）。提示經STZ誘導后小鼠胰腺組織發生糖尿病典型的病理改變，進一步表明幼齡T1DM小鼠模型制備成功。

Fig.2 Pathological changes of pancreas in STZ-induced young T1DM model mice at 28 d.See Fig.1 for the mouse treatment.A1：HE staining，the arrows show islet tissue；A2：the area of islet cells，semi-quantitative results of A1；B1：immunohistochemical staining，the arrows show insulin secretion；B2：insulin content，semi-quantitative results of B1.±s，n=10.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

2.3 幼齡T1DM模型小鼠ADSC的鑒定

2.3.1 ADSC細胞形態和細胞表面標志物

Fig.3 Morphology（A and B）and phenotype（C and D）of adipogenic stem cells（ADSCs）from young T1DM mice.See Fig.1 for the mouse treatment.A1 and B1：ADSCs digested by collagenase and amplified to the passage 3 in vitro；A2 and B2：cell morphology after Giemsa staining.

2.3.2 ADSC體外誘導成骨和成脂分化能力

分離培養的幼齡T1DM模型和正常對照組小鼠ADSC，經體外成骨誘導分化后，自分化（未誘導）組無堿性磷酸酶著色，而誘導組出現大量藍紫色（圖4A），提示ADSC堿性磷酸酶活性增強，具有成骨分化能力；RT-PCR結果顯示，誘導組ADSC Runx2和Ost mRNA表達較自分化組均顯著增加（P＜0.01）（圖4C）。采用油紅O染色檢測結果顯示，成脂誘導組ADSC出現大量紅色花環樣脂滴，脂滴融合為串珠樣，充滿整個視野，而自分化組幾乎無脂滴（圖4B）；RT-PCR結果顯示，誘導組ADSC PPARγ和CEBPα mRNA表達較自分化組亦顯著增加（P＜0.01）（圖4D）。以上結果表明，分離培養的ADSC具有多向分化能力。

Fig.4 In vitro differentiation ability of ADSCs derived from young T1DM model mice.See Fig.1 for the mouse treatment.A：osteogenic differentiation examined by alkaline phosphatase staining；B：adipocyte formation examined by Oil Red O staining；C：the key transcription factor expression during osteogenic differentiation detected by RT-PCR；D：the key transcription factors expression during adipogenic differentiation detected by RT-PCR.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with corresponding control（self differentiation）group.

2.4 幼齡T1DM模型小鼠ADSC成脂分化能力增高

進一步比較正常對照組幼齡小鼠和幼齡T1DM模型小鼠ADSC體外成脂分化能力。油紅O染色結果顯示，2組細胞經體外成脂誘導分化5 d，細胞內可見脂滴形成（圖略）。誘導分化第9天正常幼齡小鼠和T1DM模型小鼠自分化組均無脂滴出現（圖5A，數據略），但正常幼齡小鼠和T1DM幼齡小鼠誘導組均可見較多紅色脂滴，且T1DM模型組紅色脂滴大且聚集融合（圖5A），脂滴數亦顯著多于正常誘導組（P＜0.01）（圖5B）。

Fig.5 Difference in adipogenic differentiation of ADSCs in vitro between normal young mice and young mice with T1DM detected by Oil Red O staining.See Fig.1 for the mouse treatment.A：adipogenic differentiation；B：number of lipid droplets after adipogenic differentiation.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with normal control group.

RT-PCR結果（圖6）表明，正常對照組幼齡小鼠和幼齡T1DM模型小鼠ADSC成脂誘導后，PPARγ和CEBPα mRNA表達從第6天起開始升高（P＜0.01），直至誘導結束第12天，T1DM模型誘導組ADSC PPARγ和CEBPα mRNA表達均顯著高于正常誘導組（P＜0.01）。上述結果表明，T1DM模型小鼠ADSC的成脂分化能力顯著高于正常幼齡小鼠ADSC。

Fig.6 Difference in key transcription factors PPAR γ（A）and CEBP α（B）mRNA expressions in vitro between normal young mice and young mice with T1DM during induction of adipogenic differentiation of ADSCs by RT-PCR.See Fig.1 for the mouse treatment.±s，n=3.＊＊P＜0.01，compared with corresponding self differentiation group；##P＜0.01，compared with corresponding adipogenic differentiation group.

3 討論

ADSC是指存在于脂肪組織中具有自我更新和多向分化潛能的成體MSC。ADSC因其具有來源廣泛、體內含量多、免疫原性低、分離提取時對機體創傷小等優點，使ADSC具有廣闊的臨床應用前景［13］。有研究表明，ADSC可提高糖尿病患者胰島素及C肽水平，有效降低糖化血紅蛋白水平［16-17］。但因T1DM個體長期處于高血糖環境，且晚期糖基化終末物和活性氧及酮體等物質增多，這些因素是否對自身ADSC數量以及增殖能力等生物學功能產生影響目前尚不清楚，

為此，本研究利用幼齡小鼠T1DM模型，探討T1DM小鼠ADSC生物學特性是否發生改變，為闡明T1DM發病機制提供實驗依據。本研究通過連續小劑量ip給予STZ成功構建3周幼齡小鼠T1DM模型，成模后提取T1DM小鼠皮下脂肪和性腺周圍脂肪，分離培養ADSC。結果表明，幼齡T1DM小鼠ADSC的細胞形態呈成纖維樣、貼壁生長，與正常幼齡小鼠ADSC相似。經傳代后，流式細胞儀檢測其細胞表型，結果顯示均高表達CD29，CD90和Sca-1，不表達或低表達 CD31，CD45，CD34，CD11b和MHC Ⅱ，提示培養的T1DM小鼠ADSC其細胞表型與正常幼齡小鼠ADSC亦無差異。進一步對幼齡T1DM小鼠ADSC進行成脂和成骨的誘導分化。結果表明，其具有成脂和成骨的分化能力，油紅O染色和堿性磷酸酶染色均呈陽性，且相關成脂和成骨分化的關鍵轉錄因子PPARγ和CEBPα及Runx2和Ost mRNA表達均顯著增高。上述結果表明，幼齡T1DM模型小鼠即使出現明顯消瘦，但在其脂肪組織中仍存在一定數量ADSC，并且成脂分化能力增強可能補充了體內消耗的脂肪，從而維持機體代謝平衡，這為研究T1DM患者脂代謝提供了理論依據。

本研究發現，幼齡T1DM模型小鼠ADSC成脂分化能力較正常對照組小鼠ADSC顯著增強，油紅O染色脂滴數量明顯增多，且細胞內脂滴增大；T1DM模型組ADSC成脂分化關鍵轉錄因子PPARγ和CEBPα mRNA表達水平亦顯著高于正常對照組，提示T1DM模型小鼠ADSC更易分化為脂肪細胞。T1DM患者發病后多表現為體質消瘦，胰島破壞，胰島素分泌不足，導致機體不能充分利用葡萄糖產生能量，使脂肪消耗增加，脂肪細胞體積減少。

目前針對T1DM患者ADSC成脂分化能力增強的作用機制尚不清楚。以往研究結果表明，體外高糖環境和晚期糖基化終末產物增多，引起氧化應激及慢性炎癥，使ADSC成骨分化能力降低，成脂能力增強［18-19］。Pourgholaminejad等［20］報道，炎性因子可顯著提高ADSC的成脂分化能力。而T1DM作為一個慢性炎癥性疾病，是否由于患者體內的炎癥反應導致ADSC脂肪分化能力增強以維持體內脂肪代謝平衡，尚需深入探討。