D-青霉胺誘導的自身免疫性疾病模型大鼠脾組織中微RNA的表達

任禹珂，姜 華，張 頔，楊艷偉，王 超，張河戰，李 波，林 志

（中國食品藥品檢定研究院，國家藥物安全評價監測中心，藥物非臨床研究北京市重點實驗室，北京 100176）

自磺胺嘧啶可誘導狼瘡首次報道后，越來越多的藥物被證明可干擾免疫系統并導致自身免疫性疾病，即藥物誘導的自身免疫（drug-induced autoimmunity，DIA）［1］。藥物誘導的自身免疫性疾病是一種長期用藥引起的“B”型藥物不良反應，已經有近百種藥物和數十種疫苗可誘發自身免疫性疾病［2-3］。傳統的可誘發狼瘡癥狀的高風險藥物普魯卡因胺和肼苯噠嗪已逐漸退出市場。目前，藥物誘導的狼瘡與使用新的生物調節劑，如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）抑制劑和干擾素有關［2］。此外，藥物誘導的免疫毒性，也是非臨床藥物研發失敗以及臨床發生不良反應的主要原因之一。盡管藥物非臨床安全性評價有針對藥物免疫毒性評價相關指導原則ICH S8，但其并不包括藥物誘導的自身免疫毒性，所以急需尋找能夠在藥物誘導的自身免疫毒性早期做出預測的有效生物標志物。抗核抗體（antinuclear antibody，ANA）是診斷自身免疫性疾病的主要指標，但未檢測到ANA依舊不能排除發生DIA的可能性。此外，不同藥物誘發的自身免疫性疾病產生的自身抗體也可能不同，如與普魯卡因胺有關的自身抗體主要有抗組蛋白（H2A-H2B）-DNA抗體和抗心磷脂抗體［4］，與TNF-α抑制劑有關的自身抗體主要有ANA、抗雙鏈DNA（double-stranded，dsDNA）抗體和抗核小體抗體等［5］，所以急需尋找更加可靠的藥物誘導的免疫毒性的生物標志物。

大量研究表明，微RNA（microRNA，miRNA）表達的改變與免疫功能障礙和自身免疫高度相關，miRNA參與了多種自身免疫性疾病的發生和發展。miRNA存在于多種組織中，具有穩定性且易于檢測［6］。因此，其具有作為自身免疫性疾病的生物標志物的可能性。本研究采用經典DIA模型［7］，BN大鼠ig給予D-青霉胺，在不同時間點解剖，提取脾組織中的RNA，選取與自身免疫性疾病相關的4種miRNA（miR-126a-5p，miR-146a-5p，miR-27a-3p和miR-155-5p），利用莖環法RT-qPCR檢測其在脾組織表達的改變，探討miRNA作為DIA毒性生物標志物的可能性。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和儀器

D-青霉胺（貨號A11446），美國Alfa Aesar公司；ANA ELISA檢測試劑盒，美國Alpha Diagnostic International公司；Trizol總RNA提取試劑，天根生化科技（北京）有限公司；含基因組DNA（gDNA）Eraser PrimeScript?逆轉錄試劑盒、SYBR?Premix Ex Taq? Ⅱ（Tli RNase H Plus）、ROX plus和DL2000 DNA分子量標準，日本TaKaRa公司；4種miRNA引物（表1和表2），美國Invitrogen公司。LEICA ASP300脫水機、SAKURATecc4714自動包埋機、SAKURAIVS-410滑動切片機、SAKURA Tissue-TekDRS-2000全自動染色機和SAKURATissue-TekGLAS C410封片機，日本櫻花檢驗儀器株式會社；SpectraMax PLUS384酶標儀，美國Molecular Devices公司；NANODROP 2000分光光度計，美國Thermoscientific公司；ABI7500熒光定量PCR儀，美國Applied biosystems公司。

Tab.1 Primer sequences of stem loop reverse transcription

Tab.2 Primer sequences of real-time quantitative PCR（RT-qPCR）

1.2 實驗動物

30只 SPF級雄性 Brown Norway（BN）大鼠（6周齡），體重110～140 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0006。大鼠飼養于SPF屏障系統，溫度設定為20～25℃，相對濕度40%～70%，換氣次數為15 h-1，照明時間為12 h·d-1（8∶00-20∶00），給藥期間自由攝食和飲水。動物實驗經中國食品藥品檢定研究院動物倫理委員會認證批準，實驗操作符合《實驗動物管理條例》等法規的要求。

1.3 動物分組和給藥

經7 d檢疫期觀察后，30只BN大鼠按照體重隨機分為3組，每組10只（給藥7和14 d各解剖5只），分別為溶媒對照組、D-青霉胺150和450 mg·kg-1組，每天給藥1次，溶媒對照組ig給予生理鹽水。末次給藥第2天處死大鼠。腹腔靜脈采血，室溫靜置1 h后4℃，3220×g離心10 min，得血清，取上清稀釋20倍。用ELISA法檢測血清中ANA；取脾稱重后進行組織病理學檢查，剩余脾組織-80℃保存用于提取RNA。

1.4 癥狀觀察、體重測定和脾系數計算

給藥期間觀察面部脫毛及耳朵發紅等自身免疫反應。給藥1，5，7，10和14 d測大鼠體重（g），給藥7和14 d稱脾重（g），計算脾系數。脾系數=脾重/體重×100。

1.5 HE染色觀察脾組織病理改變

取1.3分組大鼠脾組織，在10%福爾馬林中固定，脫水，包埋，切片（厚度約3 μm），經蘇木精-伊紅（HE）染色后封片，在光鏡下進行病理學檢查。

1.6 ELlSA測定血清ANA水平

取1.3分組制備的血清，按照試劑盒說明書檢測血清ANA水平。使用酶標儀檢測450 nm波長處吸光度（A）值。

1.7 脾組織中總RNA的提取

取1.3分組大鼠脾組織，加入液氮后研磨，加入Trizol劇烈震蕩，室溫放置5 min；加入氯仿渦旋混勻，室溫放置5 min；12 000×g離心15 min后取上層水相，加入等體積預冷的異丙醇，充分混勻后在冰上靜置10 min；12 000×g離心15 min，棄上清；用75%乙醇洗滌沉淀，4℃，12 000×g離心5 min，棄上清；室溫晾干沉淀，加入無RNA酶雙蒸水溶解沉淀得總RNA。總RNA樣本A260nm/A280nm比值在1.8～2.1之間，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測結果表明RNA完整。

1.8 RT-qPCR檢測脾組織中miRNA表達

采用莖環法對總RNA進行逆轉錄，然后使用SYBR?Premix Ex Taq? Ⅱ（Tli RNaseH Plus），ROX plus進行實時PCR反應。使用U6作為內參基因，采用Reverse Transcriptase M-MLV參照試劑說明書進行逆轉錄。逆轉錄產物cDNA進行實時熒光定量 PCR：2×SYBR? Premix Ex Taq?Ⅱ10 μL；正向引物（10 μmol·L-1）0.5 μL，反向引物（10 μmol· L-1）0.5 μL；cDNA 2 μL；無 RNA 酶 水7 μL。ABI7500熒光定量PCR儀檢測程序：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，40 s，循環40次。擴增反應結束后，按0.05℃·s-1從60℃緩慢加熱到99℃，建立PCR產物的熔解曲線，根據熔解曲線比較擴增產物的特異性，數據采用2-△△Ct法進行分析。

1.9 統計學分析

2 結果

2.1 D-青霉胺大鼠自身免疫癥狀及體重和脾系數的變化

連續給藥第6天，D-青霉胺450 mg·kg-1組3/10大鼠開始出現耳緣結痂癥狀，第8天3/5大鼠出現耳緣結痂癥狀；150 mg·kg-1組第6天1/10大鼠開始出現耳緣結痂癥狀，第8天2/5大鼠有耳緣結痂癥狀。該癥狀為自身免疫病癥狀（圖1A）。給藥期間各組大鼠的體重均保持增長趨勢，與溶媒對照組相比給藥組無明顯變化（圖1B）。與溶媒對照組相比，給藥7 d后D-青霉胺150 mg·kg-1組大鼠脾系數顯著升高（P＜0.05），給藥14 d后450 mg·kg-1組脾系數顯著升高（P＜0.05）（圖1C）。

Fig.1 D-penicillamine-induced autoimmune manifestations（A）and changes of body mass（B）and spleen coefficient（C）.Brown Norway（BN）rats were ig administrated D-penicillamine 150 and 450 mg·kg-1once daily for 7 and 14 d，respectively，and were weighed on 1，5，7，10 and 14 d after administration.Spleen coefficint=spleen mass（g）/body mass（g）×100.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with solvent control group.

2.2 D-青霉胺致大鼠脾組織病理改變

HE染色顯示（圖2），給藥7 d后，D-青霉胺150 mg·kg-1組大鼠脾組織發生極輕度生發中心活躍伴易染體巨噬細胞數目增多，450 mg·kg-1組脾組織發生極輕度至輕度生發中心活躍伴易染體巨噬細胞數目增多。給藥14 d后，D-青霉胺150 mg·kg-1組脾組織發生極輕度至輕度生發中心活躍伴易染體巨噬細胞數目增多，450 mg·kg-1組脾組織發生輕度至中度生發中心活躍伴易染體巨噬細胞數目增多。溶媒對照組大鼠脾組織未見病理改變。

Fig.2 Spleen histopathological changes in BN rats after 7 and 14 d of D-penicillamine administration（HE staining，×4）.See Fig.1 for the rat treatment.Arrows show active germinal centers with increased numbers of tingible body macrophages.

2.3 D-青霉胺對大鼠血清ANA水平的影響

給藥7 d后，與溶媒對照組相比，D-青霉胺2個劑量組血清ANA水平無明顯變化；給藥14 d后，D-青霉胺450 mg·kg-1組血清ANA水平顯著升高（P＜0.05）（圖3）。

Fig.3 Effect of D-penicillamine on serum levels of antinuclear antibody（ANA）in BN rats after 7 and 14 d of administration.See Fig.1 for rat treatment.±s，n=5.＊P＜0.05，compared with solvent control group.

2.4 D-青霉胺對大鼠脾組織miR-126a-5p，miR-146a-5p，miR-27a-3p和miR-155-5p表達的影響

由表3所示，給藥7和14 d后，與溶媒對照組相比，D-青霉胺150和450 mg·kg-1組大鼠脾組織miR-126a-5p，miR-146a-5p，miR-27a-3p和miR-155-5p表達均顯著升高（P＜0.01）；與D-青霉胺150 mg·kg-1比較，450 mg·kg-1組脾組織4種miRNA表達亦明顯升高（P＜0.01），其中miR-155-5p升高更為明顯。給藥14 d與給藥7 d相比，D-青霉胺150和450 mg·kg-1組大鼠脾組織4種miRNA表達明顯升高（P＜0.01）。此外，D-青霉胺給藥7 d后，傳統的血清標志物ANA并未明顯升高。

Tab.3 Effect of D-penicillamine on expression of miR-126a-5p,miR-155-5p,miR-146a-5p and miR-27a-3p in rat spleen tissue

2.5 大鼠脾組織miRNA與血清ANA水平受試者操作特征曲線（receiver operating curve，ROC）分析

對給藥7和14 d 2個時間點所有大鼠的血清ANA和脾組織miRNA的檢測數據進行ROC分析，以脾組織發生病理改變為標準，出現病理損傷者為陽性大鼠（標記為“1”），未出現病理損傷者為陰性大鼠（標記為“0”），通過ROC曲線下面積（AUC）評價傳統指標ANA和miRNA的預測價值。ANA和miRNA的ROC曲線和AUC如圖4和表4所示。

Fig.4 Receiver operating curve(ROC)of ANA,miR-126a-5p,miR-155-5p and miR-146a-5p,miR-27a-3p.See Fig1.for the rat treatment.ROC curves of ANA and miRNA were drawn by SPSS17.0.

Tab.4 Area under curves(AUCs)of ANA and miRNA in spleens of rats administered with D-penicillamine

表4結果表明，4種miRNA的AUC均大于ANA，且miR-126a-5p的敏感性和特異性均高于ANA，miR-27a-3p和miR-155-5p的敏感性高于ANA，miR-146a-5p的特異性高于ANA。

3 討論

本研究結果表明，BN大鼠ig給予D-青霉胺14 d后，脾系數顯著增加，血清ANA水平顯著升高，病理學檢查見脾白髓生發中心活躍伴易染體巨噬細胞數目增多。由此表明，D-青霉胺可誘發BN大鼠產生類狼瘡樣自身免疫性疾病。

本研究結果顯示，傳統的自身免疫毒性生物標志物血清ANA的水平在ig給予D-青霉胺14 d后才開始升高，而大鼠脾組織miR-126a-5p，miR-146a-3p，miR-27a-3p和miR-155-5p在ig給予D-青霉胺7 d后即顯著升高，升高程度均高于ANA，表明這4種miRNA作為藥物誘導的自身免疫毒性生物標志物的敏感性高于血清ANA。對miRNA和ANA的ROC曲線分析結果表明，4種miRNA的AUC均大于ANA，即預測價值高于ANA。因此，在非臨床安全性評價研究中，該4種miRNA可能是較ANA更好的藥物誘導自身免疫毒性的生物標志物。

miRNA是一種內源性、長度約為22個核苷酸的非編碼RNA，它們可通過堿基互補配對與靶mRNA的3′端非翻譯區結合，抑制翻譯或使靶mRNA降解，從而在轉錄后水平調節基因表達［8］。已有研究表明，miRNA調控的改變似乎與免疫功能紊亂和自身免疫反應的發生密切相關，不同的miRNA表達譜被認為是某些自身免疫性疾病的生物標志物［9］。脾是藥物誘導的免疫毒性損傷的主要靶器官，且在非臨床藥物安全性研究中易于獲得。通過檢測脾和血液中miRNA的表達，發現脾中miRNA表達的改變更顯著，所以在藥物誘導的自身免疫動物模型中，脾miRNA是更好的研究目標［10］。其中，miR-126a-5p，miR-146a-5p，miR-27a-3p和miR-155-5p在多種自身免疫性疾病中的表達均發生了改變。miR-155可以通過作用于細胞信號阻抑物1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）促進白細胞介素2（interleukin-2，IL-2）誘導的信號轉導、轉錄激活因子5（activation of signal transducer and activator transcription 5，STAT5）信號轉導和調節性T細胞（regulatory T cells，Treg）的分化，而Treg中miR-155表達的變化可能導致自身免疫性疾病的發生［11］。miR-146a則通過靶向干擾素（interferon，IFN）調節因子5，SOCS1，STAT1，IL-1受體相關激酶1和腫瘤壞死因子受體相關因子6負調節Ⅰ型IFN信號通路，從而參與自身免疫性疾病的病理過程［12］，而miR-27a可能通過作用于胱天蛋白酶8和IL-10等基因mRNA促進自身免疫性疾病的發生［13］。目前，有研究表明，miRNA與DNA甲基化相互作用可以使T細胞高度活化從而誘發自身免疫，CD4+T細胞中miR-126a可以通過抑制DNA甲基化轉移酶1使DNA低甲基化，從而誘發系統性紅斑狼瘡［14］。總之，miRNA的異常表達可能參與藥物誘導的自身免疫毒性的發生和發展過程。

綜上所述，在藥物誘導的自身免疫毒性研究中，脾組織miR-126a-5p，miR-146a-3p，miR-27a-3p和miR-155-5p與自身性疾病的發生密切相關，且敏感性優于傳統的自身免疫性疾病生物標志物ANA，同時該4種miRNA的預測價值均高于ANA。以上結果提示，miRNA有可能成為早期診斷藥源性自身免疫毒性的生物標志物。此外，關于miRNA預測藥源性自身免疫性疾病的特異性以及參與調控藥源性自身免疫毒性的作用機制還有待深入研究。