低劑量電離輻射對小鼠小腸類器官生物學特性的影響及二甲雙胍對其輻射損傷的防護作用

宋妃靈，王思涵，林小松，張博文，3，何麗娟，裴雪濤，李艷華，3

（軍事科學院軍事醫學研究院1.輻射醫學研究所，2.衛生勤務與血液研究所，北京 100850；3.華南生物醫藥研究院華南干細胞與再生醫學研究中心，廣東 廣州 510005；4.河北大學化學與環境科學學院，河北 保定 071002）

隨著核電工程的不斷推進和發展，全球范圍內的核電工廠建設、輻射職業暴露、航空航天探索以及非法的輻射廢物堆放等活動日益增加，從事或接觸放射性工作的機構和人員也逐漸增多［1］。此外，在醫學診斷和放射治療中，X射線計算機斷層掃描（CT掃描）可以選擇性作用于異常組織如腫瘤組織，同時也可能導致正常組織發生不同程度的輻射損傷［2］。大量的研究表明，高劑量電離輻射可以引起特定組織器官甚至全身組織的嚴重損傷，而低劑量電離輻射（low-dose ionizing radiation，LDIR）對人類健康的影響存在許多不確定性，其生物學效應及分子機制仍有待進一步闡明［3］。LDIR是指劑量＜200 mGy、劑量率＜0.1 mGy·min-1的X或γ射線外照射。研究表明，LDIR對組織細胞引發的生物學效應具有多樣性。LDIR可引起細胞的興奮效應，增加機體的抵抗力，也可觸發細胞氧化應激反應增強，破壞線粒體功能，產生活性氧和活性氮等，從而導致DNA的持續氧化［4］。此外，LDIR還可誘發癌癥、白內障、心血管疾病及長期的心理影響等［5-6］。LDIR對多種組織器官可以產生不同的生物學影響［1，7］。腸道是輻射損傷的敏感組織之一，LDIR對腸道的影響也逐漸受到關注。研究發現，連續LDIR（100 mGy×50）易引起腸道持續的應激反應，導致DNA損傷［8］。近期研究表明，單次LDIR（50 mGy×1）可影響正常小鼠食管上皮祖細胞增殖和分化，促進p53突變的食管上皮祖細胞增殖［9］。腸和食管均由上皮組織覆蓋，LDIR是否對腸干細胞生長也產生影響值得關注。

小腸干細胞在腸道上皮組織的穩態維持和再生方面發揮重要作用［10］，其位于隱窩基底部，并通過不斷的自我更新和多向分化，逐漸形成腸上皮細胞結構［11］。近年來，腸類器官培養技術的出現為研究腸干細胞及腸上皮細胞損傷及再生提供了較理想的模型［12］。腸類器官是指體外在必要的細胞外基質和生長因子等微環境中培養腸干細胞，使之逐漸增殖、分化出幾乎所有類型的腸上皮細胞，形成具有多個隱窩區域的空腔樣結構，腸類器官保留了腸干細胞自我更新和多向分化的能力［13］。2007年，Hans Clevers實驗室首次證明富含亮氨酸重復序列的G蛋白偶聯受體5陽性（Lgr5+）干細胞位于腸道隱窩的基底部［14］。隨后，該實驗室在離體3D培育體系中，將腸道隱窩細胞培養形成腸道類器官［15］。類器官憑借其高度的生理相關性和體外操作的便宜性，具有替代原代細胞或永生化細胞系和動物模型的潛力。另外，類器官具有高度基因穩定性，維持了來源組織的基因型和表現型［16］。腸類器官逐漸成為疾病研究和藥物評價等的重要模型［17-20］。

文獻報道，電離輻射易引起DNA損傷［21］，造成DNA雙鏈斷裂［22］，導致組蛋白H2A變體H2AX在Ser139位點被激酶快速磷酸化，成為磷酸化組蛋白γ-H2AX，造成細胞核內γ-H2AX焦點增加。γ-H2AX已成為評價DNA損傷的關鍵標志之一［8］。有研究結果提示，LDIR可能引起細胞內的氧化應激損傷［8］，導致DNA雙鏈斷裂［22］。抗氧化劑二甲雙胍可能具有抗氧化應激損傷的作用［23-24］。本研究通過構建小鼠小腸類器官LDIR模型，明確LDIR對小腸類器官的生物學特征的影響，并探究二甲雙胍對LDIR致小腸類器官損傷的防護作用，為進一步研究LDIR的防護措施提供新思路。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑和主要儀器

C57BL/6小鼠，SPF級，雄性，6～8周齡，體重18.0～22.0 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物質量合格證號：SCXK（京）2016-0006。飼養于軍事科學院軍事醫學研究院動物中心SPF實驗室，室溫約25℃，相對濕度為40%～70%，光照時間為每天12 h，每籠5只，小鼠飼料飼養，自由飲水。所有動物實驗操作均依照軍事醫學研究院實驗動物倫理要求進行。

磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）、青霉素、鏈霉素、Ⅳ型膠原酶、達爾伯克改良伊格爾高糖培養基/營養混合物 F-12（Dulbecco′s modified eagle medium/nutrient mixture F-12，DMEM/F-12）和胎牛血清，美國Gibco公司；乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA），美國Invitrogen公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）和Ⅱ型中性蛋白酶，美國Sigma公司；IntestiCult?小鼠腸類器官生長培養基，加拿大STEMCELL公司；康寧基質膠（356231）和細胞回收溶液（354253），美國康寧公司；脫氧核糖核酸酶Ⅰ（deoxyribonuclease Ⅰ，DNase Ⅰ）和4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI），瑞士羅氏公司；多聚甲醛，中國索萊寶公司；驢血清，中國美侖生物公司；兔抗小鼠γ-H2AX單克隆抗體，美國Cell Signalling Technology公司；Alexa Fluor568標記驢抗兔IgG（H+L）抗體（熒光二抗）（A10042），美國Thermo Fisher Scientific公司；水溶性封片劑，德國VECTOR公司。

CO2恒溫細胞培養箱，美國Thermo Fisher Scientific公司；22331 Hambury離心機，德國Eppendorf公司；24孔板、40 μm細胞篩網和70 μm細胞篩網，美國康寧公司；智能恒溫水浴鍋，北京長風公司；7622型細胞涂片機，美國WESCOR公司；UltraVIEW VOX共聚焦顯微鏡，美國PerkinElmer公司；60Co源：軍事科學院軍事醫學研究院。

1.2 小鼠小腸隱窩分離和小腸類器官培養

參考STEMCELL公司“使用IntestiCult?類器官生長培養基（小鼠）進行腸類器官的建立及培養”實驗方法［25］，分離正常C57BL/6小鼠小腸隱窩。對該方法進行了改進，主要步驟如下：將小鼠的小腸組織剪成小段，置預冷的PBS中，上下反復吹打清洗。將小腸段轉移至預冷的2.5 mmol·L-1EDTA消化液中并于搖床上4℃消化孵育30 min，離心（290×g，5 min）收集沉淀，加入含0.1%BSA的PBS重懸沉淀，至顯微鏡下觀察有較多離體的U型隱窩。通過70 μm細胞篩網收集隱窩至另一離心管，回收篩網內沉淀物至原離心管中。重復過濾操作2次，共收集30 mL的濾液（內含隱窩），離心（120×g，5 min）收集沉淀。沉淀經預冷的DMEM/F-12重懸，按每孔約200個隱窩的密度種入24孔板中，每周換液3次。小鼠小腸隱窩在含有表皮生長因子、R-脊椎蛋白1（R-spondin-1）和頭蛋白（Noggin）等細胞因子的腸類器官培養基中可以持續生長，逐漸形成小腸類器官。將培養至第4天的小腸類器官用于制備LDIR小鼠模型。

1.3 小鼠小腸類器官單次或多次LDlR模型制備及二甲雙胍預處理

將培養至第4天的小腸類器官隨機分為對照組（不接受照射）、單次（100mGy×1）和多次（100mGy×4）LDIR組。單次LDIR組給予100 mGy γ射線照射1次。多次LDIR組給予100 mGy γ射線照射4次，每次間隔24 h，劑量率為2.95 cGy·min-1。二甲雙胍預處理（二甲雙胍+100 mGy×4）組，在每次100 mGy γ射線照射前2 h，向小腸類器官培養基中加二甲雙胍1 mmol·L-1，共照射4次。

1.4 小鼠小腸類器官出芽數量和表面積檢測

單次LDIR模型、多次LDIR模型和二甲雙胍+100 mGy×4組小腸類器官，均于末次照射后第3天，鏡下計數小腸類器官向各個方向伸展的芽狀突起的數量，并在小腸類器官形態圖中以標尺為基準，統計小腸類器官的表面積。每組統計30個小腸類器官。

1.5 多次LDlR小腸類器官單個細胞制備

培養于24孔板的小鼠小腸類器官經過連續4次LDIR或經二甲雙胍預處理，均于末次照射后2 h加入細胞回收溶液，于冰上靜置20 min，吹散孔內dome結構，將孔中內容物全部轉移至已提前潤濕的離心管中，離心收集沉淀（120×g，5 min）。沉淀用預冷的DMEM/F-12重懸，再次離心后沉淀用消化液（內含Ⅳ型膠原酶7.5 mL，Ⅱ型中性蛋白酶7.5 mL，DMEM/F-12 45 mL，DNA酶Ⅰ0.2 g·L-1及10%胎牛血清）重懸，充分吹打混勻，于37℃水浴鍋中孵育30 min，其間每隔10 min取出離心管，充分吹打混勻，至顯微鏡下觀察到絕大多數小腸類器官已分散為單個細胞時，通過40 μm篩網過濾細胞懸液至另一離心管，離心（740×g，5 min）收集單個細胞。

1.6 免疫熒光染色檢測單個細胞 γ-H2AX蛋白表達

將1.5制備的小腸類器官單個細胞，各離心管中加入PBS 50 μL重懸沉淀，通過細胞涂片機將細胞轉移至載玻片上。滴加4%多聚甲醛于室溫下固定細胞20 min，滴加0.2%Triton X-100于室溫下孵育15 min，而后加入10%驢血清室溫下孵育1 h，再加入兔抗小鼠γ-H2AX單克隆抗體（1∶100）4℃過夜孵育。次日，滴加Alexa Fluor 568標記驢抗兔IgG（H+L）抗體（熒光二抗）（1∶400）于室溫孵育1 h，再滴加DAPI，室溫下孵育15 min。各步驟均由PBS洗滌細胞后進行。水溶性封片劑封片，于4℃避光保存。將共聚焦顯微鏡調節至油鏡，觀察并統計單個細胞內γ-H2AX焦點數，表示細胞核內γ-H2AX蛋白表達水平。

1.7 統計學分析

2 結果

2.1 小鼠小腸隱窩的分離和小腸類器官的培養

由圖1可見，小鼠小腸隱窩接種入24孔板后的第1天，成活的小腸隱窩逐漸變為囊狀的類圓球形結構，分布不均，大小不等，形態透亮，輪廓清晰可見。第2天開始，圓球形結構逐漸增大，內部類似于小腸腔的中空結構。當小腸隱窩培養至第3天，在圓球形結構的外側會有少量芽狀上皮結構向各方向伸展突起。至培養第4天時，隱窩中的細胞逐漸發育形成較為完整的小腸類器官結構。隨著培養天數的延長，小腸類器官的出芽數量也逐漸增加。原代小腸類器官培養至第6天，其出芽特征更為明顯。此時，小腸類器官體積和表面積較大，通常需要傳代培養。

Fig.1 Schematic diagram and morphological changes of normal mouse intestinal crypt and organoid culture.A：schematic diagram；B：morphological changes of primary mouse intestinal organoids at the 1stday（D1）to D6 after crypt isolation.The red arrows show an intestinal organoid.

2.2 單次LDlR對小腸類器官生長的影響

小腸類器官單次LDIR后第3天觀察小腸類器官形態改變，出芽數量和表面積見圖2。與對照組相比，單次LDIR組小腸類器官的出芽數量和表面積無明顯差別，表明單次LDIR對小鼠小腸類器官的生長特性無明顯影響。

Fig.2 Morphological analysis of mouse small intestinal organoids at D3 after single low-dose ionizing radiation（LDlR）（100 mGy×1）.A：time schedule；B1：the morphology of the small intestinal organoids；B2：the number of buds per organoid；B3：the surface area per organoid.±s，n=30.

2.3 多次LDlR導致小鼠小腸類器官生長減慢

小腸類器官多次LDIR后第6天（末次照射后第3天）觀察小腸類器官形態改變，出芽數量和表面積見圖3。與對照組相比，多次LDIR組出芽數量和表面積均明顯降低（P＜0.01），表明多次LDIR延緩了小腸類器官的正常生長發育。

Fig.3 Morphological analysis of mouse small intestinal organoids at D6 after multiple LDlR(100 mGy×4).A:time schedule;B1：the morphology of the small intestinal organoids；B2：the number of buds per organoid；B3：the surface areas per organoid.±s,n=30.＊＊P＜0.01,compared with control group.

2.4 多次LDlR引起小腸類器官細胞內DNA損傷

用熒光顯微鏡對小腸類器官細胞內DNA損傷進行可視化定量分析發現（圖4），與對照組相比，多次LDIR組小腸類器官細胞核內γ-H2AX焦點數明顯增多（P＜0.01），表明多次LDIR可引起小腸類器官細胞內DNA損傷。

Fig.4 lmmunostaining analysis of γ-H2AX protein expression in single cells of mouse small intestinal organoids at 2 h after last radiation of multiple LDlR（100 mGy×4）.B was the quantitative result of A.±s,n=20.＊＊P＜0.01,compared with control group.

2.5 二甲雙胍對小腸類器官LDlR損傷的防護作用

圖5結果表明，與對照組相比，多次LDIR組小腸類器官出芽數量和表面積均明顯減少（P＜0.01），細胞核內γ-H2AX焦點數明顯增多（P＜0.01）。與多次LDIR組相比，二甲雙胍+100 mGy×4組小腸類器官出芽數量和表面積均明顯增加（P＜0.01），并且細胞核內γ-H2AX焦點數明顯減少（P＜0.01）。

Fig.5 Effect of metformin pre-treatment on images of mouse small intestinal organoids at D6 after multiple LDlR and γ-H2AX protein expression in single cells of mouse intestinal organoids at 2 h after last radiation of multiple LDlR（100 mGy×4）.A：time schedule for mouse small intestinal organoids receiving multiple LDIR（100 mGy×4）and metformin pre-treatment（metformin 1 mmol·L-1was supplemented into the medium at 2 h before each irradiation）；B1：the morphology of the small intestinal organoids，including the bud numbers and the surface areas per organoid；B2：quantitative analysis results of B1；C1：immunostaining of γ-H2AX protein；C2：quantitative analysis results of C1.±s，n=30（B），20（C）.＊＊P＜0.01，compared with control group；##P＜0.01，compared with multiple LDIR group.

3 討論

LDIR對人類健康產生影響。如LDIR可能誘發癌癥發生，增加心腦血管疾病、精神神經性疾病（如認知障礙等）、眼部疾病（如白內障等）及其他系統疾病（呼吸和消化系統）等［26］。但也有研究報道，LDIR可能帶來一些積極影響，如減少基因突變、促進生長發育、增強免疫應答、預防疾病及延長平均壽命等［1］。此外，LDIR還可誘發“適應性反應”、“旁觀者效應”等［2］。機體各組織對電離輻射的耐受性和反應性存在很大差異。腸道對電離輻射十分敏感，LDIR對腸道的影響也備受關注［7，27］。腸上皮細胞是成年哺乳動物體內更新較為快速的細胞之一，位于隱窩基底部的小腸干細胞通過不斷的自我更新、遷移分化為各種功能細胞（如杯狀細胞、潘氏細胞和腸內分泌細胞等），維持腸上皮結構的完整性［10，28］。

近年來，腸類器官技術的迅猛發展為腸道疾病研究提供了極好的模型。腸類器官含有幾乎所有類型的腸細胞，包括腸上皮細胞、腸干細胞、杯狀細胞和腸內分泌細胞等［18］，再現了腸上皮的生理結構，并保持了體內腸道的再生特性［29］，逐漸應用于疾病模型研究、藥物評價等領域［30］，也增加了體外研究操作的便宜性。Hans Clevers實驗室在2009年最早報道了基于基質膠及培養基中添加表皮生長因子，R-脊椎蛋白1和頭蛋白等的三維培養體系，將小鼠小腸隱窩細胞誘導生成小腸類器官的新技術［15］，并通過分析腸類器官的形態、腸干細胞及腸上皮細胞的關鍵蛋白表達情況等來對小腸類器官的特性進行鑒定。本課題組參考此方法在實驗室成功建立了小鼠小腸類器官培養擴增及鑒定的體系［31］。此外，本課題組前期基于腸類器官培養技術建立了大劑量電離輻射致小腸類器官損傷的模型，并篩選和評價了能促進輻射損傷腸干細胞再生的小分子化合物［31］。這一研究工作基礎有助于研究基于腸類器官模型進一步評價LDIR對腸干細胞生物學特性的影響。

本研究分離出正常小鼠的小腸隱窩。由于腸隱窩內含有腸干細胞，成活的隱窩會逐漸生長成類球形結構，而后逐漸開始增大，向各個方向伸展出多個分支狀結構，于培養第4天形成較為完整的小腸類器官結構，這與腸干細胞不斷增殖及分化有關［15］。隨后，觀察了單次LDIR（100 mGy×1）對小腸類器官生長的影響。由于腸類器官的生長及腸干細胞增殖及分化需要足夠的時間，因此本研究選擇末次LDIR后第3天分析小腸類器官生長情況。研究結果發現，單次LDIR對小腸類器官生長無明顯影響。文獻報道，LDIR多存在連續暴露的現象［9］。因此，本研究制備了小腸類器官多次LDIR（100 mGy×4）模型，在末次照射后第3天對小腸類器官的形態進行分析，發現經過多次LDIR后小腸類器官的出芽數量和表面積均明顯降低，表明多次LDIR減緩了小腸類器官的生長發育。

γ-H2AX的免疫熒光染色結果提示，多次LDIR導致小腸上皮細胞內的DNA損傷。細胞內DNA損傷會導致細胞凋亡增多，細胞增殖減少。多次LDIR引起小腸類器官生長抑制可能與其導致的小腸上皮細胞內DNA損傷有關。有文獻報道，LDIR會造成細胞內的氧化應激損傷［8］，抗氧化劑則可預防該損傷［32］。二甲雙胍是一種口服降糖藥［33］，但其作用不止降糖，已被證實其具有抗氧化作用。例如，中藥復方（SPTC）與運動或二甲雙胍聯合使用可通過下調氧化應激通路激活Nrf2-Keap1軸，更有效地緩解2型糖尿病小鼠的并發癥等［34］，并且其在延緩衰老［35］和減輕胃腸道放射毒性［36］等多方面均顯示出應用價值，推測二甲雙胍可能具有潛在的保護LDIR引起的小腸類器官損傷的作用。用小腸類器官多次LDIR模型，在每次LDIR前2 h將二甲雙胍加入培養基，發現與多次LDIR組相比，二甲雙胍預處理能明顯抑制多次LDIR造成的小腸類器官出芽數量和表面積減低的效應，提示小腸上皮細胞內DNA損傷明顯減輕。該研究結果提示，二甲雙胍具有保護小腸上皮細胞免于多次LDIR造成的損害效應，可有效減輕小腸類器官在LDIR中受到的損傷。

綜上所述，單次LDIR對小腸類器官的生長發育無明顯影響，多次LDIR會造成小腸上皮細胞DNA損傷，導致小腸類器官的生長受到抑制。二甲雙胍可有效減少LDIR造成的小腸上皮細胞的損害效應。本研究結果為更好地認識LDIR對腸組織的影響及尋找有效防護藥物奠定基礎。