破壁前后油菜蜂花粉中黃酮類化合物定性定量分析

肖興英 喬江濤 張紅城

（中國農(nóng)業(yè)科學院蜜蜂研究所，北京 100093）

油菜蜂花粉為十字花科蕓薹屬植物油菜（Brassica campestrisL.）的蜂花粉粉末，是我國蜂花粉重要的大宗交易品之一[1]。油菜蜂花粉具有抗前列腺炎、抗衰老及美容養(yǎng)顏等作用，其中主要含有氨基酸、脂肪酸、礦物質(zhì)、植物甾醇[2,3]、類黃酮、酚酸衍生物糖苷等植物次級代謝產(chǎn)物[4,5]。黃酮類化合物廣泛存在于蜂花粉中，具有降血脂血壓、抗動脈硬化、抗炎等作用，可以參與機體的氧化應(yīng)激、清除羥基、DPPH自由基[6]，因而在預(yù)防糖尿病、心血管疾病等方面發(fā)揮作用[7]。目前，蜂花粉中的黃酮類物質(zhì)研究是一熱點，對油菜蜂花粉中破壁前后黃酮類化合物成分含量變化的報道尚不全面。本文在實驗室已有的研究基礎(chǔ)上[8]，采用高效液相色譜四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-QTOFMS），對油菜蜂花粉中的黃酮類化合物進行結(jié)構(gòu)鑒定，并對比蜂花粉破壁前后的成分變化，以期為油菜蜂花粉黃酮類成分的生物活性及藥理學作用研究提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑

分析純甲醇、無水乙醇、甲酸、維生素C、維生素E 購自北京索萊寶科技有限公司；色譜級甲醇、乙酸、質(zhì)譜級乙酸、磷酸鹽緩沖液購自美國Fisher 公司；槲皮素-3-O-槐糖苷、山奈酚-3-O-槐糖苷購自美國Sigma 公司；實驗用水為超純水。

1.2 實驗材料

油菜蜂花粉樣品為2018年、2019年、2020年采自江西婺源、江嶺、青海門源等地區(qū)，樣品采集后存放于4℃冰箱備用。

表1 油菜蜂花粉樣品信息

1.3 實驗儀器設(shè)備

Sorvall ST8 ST8R 型臺式離心機，美國Thermo Fisher 公司；無菌注射器，江蘇正康醫(yī)療器械有限公司；0.22μm 微孔濾膜，Milipore 公司；移液器，美國Thermo 公司；JC-QXS-4.5L 型數(shù)控超聲波清洗器，中國昆山市超聲儀器有限公司；超純水系統(tǒng)，Merk Millipore 公司；LC-6AD 高效液相色譜儀，日本島津公司；AVANCE III 500MHz 核磁共振波譜儀，配有低溫探頭（Bruker）；AD-9925 型真空泵，天津奧特塞恩斯儀器有限公司；氮吹儀，冠森生物科技上海公司；高效液相色譜儀和6520四級桿-飛行時間質(zhì)譜（Q-TOF），美國Agilent 公司；JECHERS 自動樣品制備系統(tǒng)，中國上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司；Thermo Sorvall Biofuge Startos 型臺式離心機，美國Thermo Fisher 公司；DCTZ-100 三頻多用途恒溫超聲提取機，北京弘祥隆生物技術(shù)開發(fā)有限公司；FA2 弗魯克高剪切分散乳化機，上海弗魯克流體機械制造有限公司；LGJ-18S 真空冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；AL104 電子天平、Seven Easy pH 計，Mettler-Toledo 公司。

1.4 方法

1.4.1 蜂花粉的破壁處理

稱取80g 油菜蜂花粉于1000mL 燒杯中，加入800mL 超純水，攪拌溶解。向溶液中加入磷酸鹽緩沖液pH 值至3.50，加入2.0g 維生素C、0.4g 維生素E 后，采用超聲-高剪切聯(lián)用法進行破壁處理。首先，高剪切處理，溶液放置在冰浴中，轉(zhuǎn)速為25000rpm，時間為50s。其次采用超聲破壁處理，超聲功率為1000W，超聲頻率為80Hz，超聲溫度為20℃，采用間歇超聲法，即超聲20min 停歇半小時，總超聲時間為4h。最后，將破壁處理的樣品真空冷凍干燥至恒重，-18℃冰箱中保存?zhèn)溆肹8]。

1.4.2 蜂花粉樣品前處理

稱取3g 油菜蜂花粉置于50mL 離心管中，用75%乙醇溶解并定容至30mL。離心管中加入標準轉(zhuǎn)子后放入自動樣品制備系統(tǒng)，頻率60Hz，運行時間120s。取出轉(zhuǎn)子，蜂花粉懸濁液配平后在5000r/min 條件下離心10min，之后除去蜂花粉懸濁液中的固體不溶物。取上清液置于樣品管中，從樣品管中取2mL上清液，0.22μm微孔濾膜過濾后，用于HPLC 分析。

1.4.3 蜂蜜樣品的高效液相色譜分析條件

色譜柱：Phenomenex Gemini C18（150mm×4.6mm，5μm）；樣品進樣量為20μl、油菜蜂花粉的檢測波長270nm；柱溫箱溫度為36℃。流動相A：超純水（含0.2%的甲酸），流動相B：甲醇（含0.2%的甲酸），總流速0.7ml/min。

油菜蜂花粉的梯度洗脫程序為：0～10min，5%～22%B；10～15min，22%～27% B；15～30min，27%～31% B；30～45min，31%～33% B；45～75min，33%～40% B；75～105min，40%～45% B；105～110min，45%～49% B；110～145min，49%～59% B；145～150min，59%～80%B。

1.4.4 樣品質(zhì)譜分析條件

液相質(zhì)譜（LC-QTOF）分析條件：離子源為ESI源（電噴霧），離子源噴射電壓為4kV，出口電壓為130V，加熱溫度350℃，氮氣流速為11L／min，碰撞氣體為氦氣，霧化氣流速為80kPa，霧化器的壓力40psi，質(zhì)量掃描范圍m/z=100～900Da。

2 結(jié)果與分析

2.1 油菜蜂花粉化合物組成分析

油菜蜂花粉提取物經(jīng)HPLC分離結(jié)果如圖1所示，從圖中，可以清楚的看到油菜蜂花粉中所含物質(zhì)豐富，出峰時間緊湊，分別在25min、40min 和105min 成蔟出現(xiàn)，對圖1所示所有峰進行出峰時間和紫外光譜對比。根據(jù)文獻查閱對比、HPLC-MS 鑒定數(shù)據(jù)對比及標品驗證，對圖1標注結(jié)果化合物1 和化合物2 進行鑒定，結(jié)果如表2。

圖1 油菜蜂花粉HPLC譜圖

表2 正離子模式下HPLC-ESI QTOF-MS/MS油菜蜂花粉中黃酮類化合物

2.1.1 化合物1

圖2及表2一級和二級質(zhì)譜圖為化合物1 在正離子模式下的分子離子峰，可知化合物1 的準分子離子峰[M+H]+為627.1554m/z 及[M+Na]+649.1373m/z 的分子離子峰，因此化合物1 的分子量為626Da。通過比對圖2二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)斷裂碎片，進一步推測化合物裂解途徑論證該化合物結(jié)構(gòu)，其表現(xiàn)為顯著的多酚類化合物的電離特征。準分子離子峰[M+H]+(m/z)在斷裂1 個葡糖苷（C6H5O10）碎片后，產(chǎn)生分子離子碎片峰[M+H]+465.1022m/z，而后在第二次相繼斷裂1 個葡糖苷（C6H5O10）碎片，得到分子離子碎片峰[M+H]+303.0498m/z，最終得到相對分子質(zhì)量303Da 即為槲皮素相對分子質(zhì)量。結(jié)合紫外光譜，化合物1 在255nm 和348nm 處有最大吸收峰，符合多酚類紫外吸收特征。為驗證我們的猜測，采用內(nèi)標法進行標準品驗證。標準品為槲皮素-3-O-槐二糖苷（Quercetin 3-O-sophoroside），分子式為C27H30O17，CAS 號為18609-17-1，鑒定結(jié)果與文獻報道一致[9-14]。因此，化合物1 最終鑒定為槲皮素-3-O-槐二糖苷。

圖2 正離子模式下化合物1的質(zhì)譜圖（LC-QTOF-MS/MS）

2.1.2 化合物2

圖3和表2一級和二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)為化合物2 在正離子模式下確定的分子離子峰，可知化合物2 的準分子離子峰[M+H]+為611.1597m/z 及[M+Na]+633.1414m/z 的分子離子峰，因此化合物2 的分子量為610Da。通過比對圖3二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)斷裂碎片，進一步推測化合物裂解途徑論證該化合物結(jié)構(gòu)，二級質(zhì)譜斷裂表現(xiàn)為顯著的多酚類化合物的電離特征。準分子離子峰[M+H]+(m/z)在斷裂1 個葡糖苷（C6H5O10）碎片后，產(chǎn)生分子離子碎片峰[M+H]+449.1066m/z，而后在第二次相繼斷裂1 個葡糖苷（C6H5O10）碎片，得到分子離子碎片峰[M+H]+287.0543m/z，即最終得到相對分子質(zhì)量287Da即為山奈酚相對分子質(zhì)量。結(jié)合紫外光譜，化合物2在265nm 和348nm 處有最大吸收峰，符合多酚類紫外吸收特征。為驗證我們的猜測，采用內(nèi)標法進行標準品驗證。標準品為山奈酚-3-O-槐二糖苷（Kaempferol 3-O-sophoroside），分子式為C27H30O16，CAS 號為19895-95-5，其純度為98%以上；鑒定結(jié)果與文獻報道一致[15-19]。因此，化合物2 最終鑒定為山奈酚-3-O-槐二糖苷。

圖3 正離子模式下化合物2的質(zhì)譜圖（LC-QTOF-MS/MS）

2.2 破壁前后油菜蜂花粉中化合物含量測定

以槲皮素-3-O-槐二糖苷為標準品，配制成濃度為200μg/mL 標準液，分別進樣10、20、30、40、50μL，平行測定三組，以進樣量為X 軸，峰面積為Y 軸繪制標準曲線，結(jié)果如表3，其回歸方程為Y=838511X-297448，相關(guān)系數(shù)為R2=0.991，表明槲皮素-3-O-槐二糖苷進樣量在0～10μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，靈敏度較高。

以山奈酚-3-O-槐二糖苷為標準品，配制成濃度 為1.28mg/ml 標準液，分別進樣2、6、10、14、18μl，平行測定三組，以進樣量為X 軸，峰面積為Y 軸繪制標準曲線，結(jié)果如表3，其回歸方程為Y=1000000X+105510，相關(guān)系數(shù)為R2=0.998，表明山奈酚-3-O-槐二糖苷進樣量在0～25μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，靈敏度較高。

表3 標準品線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)

結(jié)果如表4所示，油菜蜂花粉樣品中均檢測到槲皮素-3-O-槐二糖苷和山奈酚-3-O-槐二糖苷，其中兩種化合物平均值之和達到13.43mg/g，占花粉的1%以上。16 個油菜蜂花粉中黃酮類成分在破壁前槲皮素-3-O-槐二糖苷含量范圍為2.96～6.23mg/g，其平均含量為4.26±1.12mg/g。在破壁后，槲皮素-3-O-槐二糖苷含量明顯增加，含量范圍為6.33～8.27mg/g，其平均值達到7.39mg/g，高出未破壁相應(yīng)成分3.13mg/g。山奈酚-3-O-槐二糖苷在破壁前含量范圍為7.05～13.73mg/g，其平均含量9.17±2.14mg/g。在破壁后，山奈酚-3-O-槐二糖苷含量明顯增加，含量范圍為10.65～16.30mg/g，其平均值達到13.55mg/g，高出未破壁相應(yīng)成分4.38mg/g。以上成分含量的變化，進一步說明破壁有利于成分的釋放。

表4 不同產(chǎn)地油菜蜂花粉中黃酮類和精胺類化合物含量

3 討論與結(jié)論

本研究采用HPLC-QTOF-MS 法和內(nèi)標驗證法，檢測到油菜蜂花粉中黃酮類物質(zhì)為槲皮素-3-O-槐二糖苷和山奈酚-3-O-槐二糖苷。對兩種化合物進行定量分析發(fā)現(xiàn)，在破壁后，兩種化合物的含量均有所提升。破壁后，槲皮素-3-O-槐二糖苷平均值達到7.39mg/g，含量提高了73.5%，占花粉的0.7%以上。山奈酚-3-O-槐二糖苷平均值達到13.55mg/g，含量提高了47.8%，占花粉的1.3%。楊佳林[20]以油菜蜂花粉為原料，經(jīng)測定，天然油菜蜂花粉中山奈酚-3--O-(2”-O-β-D-吡喃葡萄糖)-β-D-葡萄糖的含量為0.313%±0.0001。以上成分含量的變化，進一步說明破壁有利于成分的釋放。這是首次在油菜蜂花粉中通過高剪切-超聲聯(lián)用技術(shù)，對比破壁前后槲皮素-3-O-槐二糖苷和山奈酚-3-O-槐二糖苷的含量變化。這兩種化合物有多種生物功能，具有降血脂、抗氧化、降低膽固醇、抗炎等[21,22]功效。研究表明油菜蜂花粉中的黃酮類化合物對羥基自由基有較好的清除率，在25～100mg/ml 的范圍里濃度與清除率呈線性關(guān)系[23]。此外，定量分析結(jié)果還為后期黃酮類成分的生物學活性及其藥理學作用的研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。