四溴雙酚A對人體正常肝細胞毒性效應及作用機制

王曉麗，張運超，夏滬彬，陳超，劉勇弟, *

1. 華東理工大學資源與環境工程學院，上海200237 2. 華東理工大學生物工程學院，上海200237

四溴雙酚A(TBBPA)是目前產量最大的溴系阻燃劑，由于其良好的阻燃、耐熱性能等優點，廣泛應用于生活的各個方面，如家用電器、家具、塑料和電子產品等。TBBPA可阻止或降低燃燒的速度，同時也可以防止添加的材料燃燒[1]。TBBPA可分為添加型和反應型2種類型，其中，添加型未形成新的化學鍵，易釋放至環境中；反應型通過化學反應加入阻燃成分，以形成化學鍵的形式與材料結合，這種結合方式相對穩定，但是其中未聚合的TBBPA也會釋放到環境中。在含有TBBPA的產品生產、使用及產品廢棄之后堆放、填埋或者焚燒等處理過程中，TBBPA通過揮發、滲透等途徑進入環境。TBBPA進入環境后，在不同介質之間進行遷移轉化。在大氣、土壤、水體沉積物及生物體中已被檢出。土壤中TBBPA的污染狀況已有報道。Yu和Hu[2]在垃圾填埋場附近的土壤中測得TBBPA濃度為1.4～1.8 μg·g-1(干重)。彭浩等[3]研究發現，在電子廠周圍的土壤樣本中TBBPA的濃度為(25.2±2.7) ng·g-1。?berg等[4]在22處用市政廢水澆灌的土壤中取116個污泥樣品，測定出TBBPA的含量在220 ng·g-1范圍內；清遠的電子廢物回收站點土壤中TBBPA污染水平極高，其濃度高達780 ng·g-1。電子廢物回收站點的TBBPA濃度明顯高于農田土壤，但與某些工業區土壤的污染水平相當，表明電子廢物回收和工業場所是這些地區TBBPA的主要來源[5]。水環境中TBBPA的污染狀況也有很多報道，Watanabe等[6]1983年在日本的Neya河的淤泥中檢出了TBBPA，其含量為1.8～20 ng·g-1(干重)。Chu等[7]測定了加拿大的廢水處理廠樣本中TBBPA含量，其范圍為2.1～28.3 ng·g-1(干重)；Saint-Louis和Pelletier[8]測定了加拿大Saint Lawrence河底泥中TBBPA含量，為300 ng·g-1(干重)。在中國，除了黃河和巢湖外，其余水體中檢測到的TBBPA濃度普遍<10 ng·L-1；黃河和巢湖水系TBBPA濃度較高，安徽省巢湖水樣中TBBPA含量最高，遠高于環境水域的全球水平[9]。大氣中的TBBPA主要來源于電子產品的生產及回收。Takigami等[10]測定了在日本北海道采集的2個室內灰塵樣本，其中，TBBPA含量分別為49 ng·g-1和52 ng·g-1，室內空氣中的TBBPA分別為12～20 pg·m-3和8～10 pg·m-3，室外空氣中分別為9.5 pg·m-3和7.1 pg·m-3。在中國貴嶼的一個電子廢物回收站點檢測到的TBBPA的濃度平均值為82 850 pg·m-3[5]。Yu和Hu[2]測定了從中國一個辦公室的計算機房內采集到的4個灰塵樣品，其TBBPA含量為18.9～39.6 μg·g-1。TBBPA會對生物體造成危害。Herzke等[11]采集分析了挪威6種食肉性鳥類的鳥蛋中溴代阻燃劑的濃度水平，8個樣品中都檢出TBBPA且含量約為13 pg·g-1(濕重)；Law等[12]測定了英國海域的68個海豚脂肪樣品，其中，18個樣品中檢出的TBBPA濃度為6～35 ng·g-1(濕重)。最近人體內TBBPA含量的報道主要集中在母乳和血液樣本。Shi等[13]調查了中國24組母乳樣品和食物樣品，其中，肉、蛋和水產品中TBBPA的平均含量分別為263、194和738 pg·g-1(脂重)，母乳中TBBPA的含量為5 124 pg·g-1(脂重)，嬰兒通過母乳每日TBBPA的攝入量為320～37 240 pg·kg-1，平均為5 094 pg·kg-1(體重)，成人日攝入TBBPA的平均值為256 pg·kg-1(體重)，肉類產品是人類攝入TBBPA的主要來源。

TBBPA可通過皮膚接觸、呼吸和進食等途徑進入生物和人體內，TBBPA對生物體有很強的毒性效應，目前研究的重點是內分泌干擾性、神經毒性和生殖發育毒性等。研究表明，TBBPA在中國倉鼠卵巢細胞和蝌蚪變態過程中表現出抗甲狀腺激素活性[14]。神經行為學研究表明，TBBPA急性暴露3 h會增加小鼠的運動行為，0.1 mg·kg-1和5 mg·kg-1劑量的處理組中小鼠相比對照組有更強的恐懼行為表現[15]。研究表明，當TBBPA濃度<1.5 μmol·L-1時，會使斑馬魚早熟，產卵率、孵化率和仔魚成活率下降[16]。但是TBBPA對人體肝臟毒性的研究尚且不足，對TBBPA的人體肝毒性報道相當有限，未對其凋亡機制進行具體研究。另外，肝臟是人體主要的代謝和解毒器官，可以促進多種酶的合成進而對進入體內的外源毒性物質進行清除。探究TBBPA的肝毒性對于評價其對人體健康的毒性效應具有十分重要的意義。

在本研究中，用L02細胞作為受體模型來研究TBBPA的肝細胞毒性，并探討細胞內活性氧(ROS)含量變化、細胞DNA損傷和細胞凋亡的變化，闡明TBBPA對L02細胞的細胞毒性作用及相關機制。進一步拓寬了TBBPA毒性研究的領域，并為相關的環境管理提供毒理學參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 L02細胞來源

人體肝細胞HL-7702(L02)細胞系購自中國科學院的細胞庫類型培養物保藏中心(上海，中國)。

1.2 L02細胞實驗預處理

取對數期細胞，培養瓶中貼壁細胞密度達到70%～80%，用磷酸緩沖溶液(PBS)洗滌細胞2次，消化后加入DMEM培養基制成細胞懸液，依次接種于滅菌后的6孔板中，每孔加入2 mL，在37 ℃、5% CO2條件下培養15 h。棄上清液，用PBS洗滌細胞2次，加入含有5、10、20和40 μmol·L-1TBBPA的培養基用于脅迫實驗，溶劑對照組為含0.1%二甲基亞砜(DMSO)的完全培養基，每組濃度設3個平行。在37 ℃、5% CO2下孵育48 h后，用移液槍吸出培養基，用PBS緩慢洗滌細胞2次。

1.3 L02細胞形態變化

細胞預處理同1.2部分，立即在倒置顯微鏡(IX71-F22RC，OLYMPUS，日本)(200×)下觀察，并拍照。

1.4 L02細胞活力檢測

脅迫細胞預處理同1.2部分，加入2.5、5、10、20、40、80、100和200 μmol·L-1的TBBPA進行脅迫實驗，在37 ℃、5% CO2的條件下繼續培養24、48和72 h。每孔加入20 μL MTT液(5 g·L-1)，繼續孵化4 h。棄去上清液，向每個孔里加入170 μL DMSO，在37 ℃振蕩15 min，用酶標儀(Elx808，BIOTEK，美國)檢測每個孔在490 nm處吸光度值(OD)，并按式(1)計算細胞相對活力。

RAC=(OD濃度-OD調零)/(OD對照-OD調零)×100%

(1)

式中：RAC為細胞相對活力(%)；OD濃度為實驗組吸光度值；OD調零為調零組吸光度值；OD對照為對照組吸光度值。

1.5 L02細胞內氧化應激指標的測定

細胞收集和處理參照1.2部分。在37 ℃、5% CO2下孵育12 h后，對細胞進行消化并收集在離心管中，1 200 r·min-1離心5 min，棄去上清液。收集細胞并懸浮在用無血清培養液稀釋的DCFH-DA中，在37 ℃細胞培養箱內孵育15 min，探針和細胞充分接觸。使用流式細胞儀檢測ROS，激發波長為488 nm，發射波長為525 nm。使用脂質過氧化測定試劑盒測量丙二醛(MDA)含量。將細胞收集在離心管中，離心后，棄去上清液并提取MDA。將樣品在離心管中混合，在水浴中保溫30 min后，進行冰浴和離心以測量532 nm和600 nm的吸光度；收集細胞并用PBS洗滌2次。分光光度計將波長調節至412 nm，測量在412 nm處30 s和150 s的吸光度(A1和A2)，并制成標準曲線。最后，將樣品的吸光度引入標準曲線公式，計算每0.1 g細胞樣品中還原型谷胱甘肽(GSH)或氧化型谷胱甘肽(GSSG)的含量。

1.6 L02細胞內DNA損傷的測定

細胞收集和處理參照1.2部分。將細胞消化并在離心管中收集，1 200 r·min-1離心5 min，棄去上清液，PBS洗滌細胞2次。鋪片、細胞進行裂解、漂洗，將載玻片置于冷卻至4 ℃的堿性電泳液，解旋后電泳、加PI、蓋玻片，熒光顯微鏡(Eclipse 80i，NIKON，日本)下觀察、拍照(激發波長530 nm，觀察波長>630 nm)。用CASP圖像分析軟件分析彗星圖像，本實驗采用尾部DNA百分含量(Tail DNA%)作為定量衡量彗星拖尾程度的指標。

1.7 L02細胞凋亡分析

細胞收集和處理參照1.2部分。將細胞消化并在離心管中收集，1 200 r·min-1離心5 min，消化細胞收集在離心管中，離心后棄去上清液；加入預冷PBS，重懸細胞，再次離心棄上清；分別加入5 μL的FITC-Annexin V及PI染液，室溫下避光染色5～10 min，在1 h內用流式細胞儀進行檢測，結果使用FACSDiva 4.1軟件分析。

1.8 數據統計與分析

本實驗所有數據的表達均采用平均值±標準誤差的形式，數據統計分析采用的處理軟件是SPSS18.0(SPSS, Chicago, IL, USA)，統計分析方法是方差分析(analysis of variance, ANOVA)。繪圖采用Origin 8.0軟件(OriginLab, Northampton, MA, USA)。顯著性水平達P<0.05和P<0.01為差異顯著。

2 結果(Results)

2.1 TBBPA對細胞形態影響

TBBPA處理L02細胞48 h后其形態變化如圖1所示。由圖1可知，正常L02細胞數量多，邊界清楚，細胞折光率良好，L02細胞形態具有良好梭形，并且邊緣清晰、肝細胞明亮。TBBPA處理48 h后，與對照組相比，5 μmol·L-1劑量組中L02細胞未顯示顯著形態學的變化。隨著TBBPA濃度的增加，L02細胞的數目慢慢減少，死亡細胞數量增多，細胞形態改變，并且大部分細胞傾向于變扁、變小和變圓。當濃度達到10 μmol·L-1時，L02細胞數量顯著減少，細胞體積變小，部分細胞出現邊緣模糊，甚至消失；在40 μmol·L-1劑量組暴露48 h后，細胞形態變圓，并且貼壁細胞形態趨于扁平，貼壁細胞減少，與周圍的細胞脫離。細胞數量也達到最低。這表明，TBBPA對L02肝細胞具有毒性。

圖1 L02細胞形態變化注：DMSO表示二甲基亞砜溶劑組。Fig. 1 Morphological changes of L02 cellsNote: DMSO means dimethyl sulfoxide solvent control.

2.2 TBBPA對細胞活力的影響

為了研究TBBPA對L02細胞活性的影響，用不同劑量的TBBPA處理L02細胞24、48和72 h后，MTT法測定細胞存活率。如圖2所示，隨著TBBPA劑量和脅迫時間的增加，L02細胞活力降低的程度不同。TBBPA濃度為5、10、20、40、80、100和200 μmol·L-1時，48 h暴露使細胞活力呈濃度依賴方式顯著降低(P<0.05)。濃度為2.5 μmol·L-1時未發現顯著的細胞死亡。當細胞暴露于5、10、20和40 μmol·L-1TBBPA 48 h后，觀察到明顯的細胞死亡(圖2)。TBBPA將細胞活力分別降低至82.2%±1.05%、80.7%±0.63%、72.3%±0.89%和57.5%±0.79%。結果表明，TBBPA能夠顯著降低L02細胞活性。

圖2 2.5～200 μmol·L-1四溴雙酚A(TBBPA)暴露24、48和72 h后對L02細胞增殖的影響注：數據表示為平均值±標準誤差，n=6；D表示DMSO溶劑對照組；*P<0.05、**P <0.01，與DMSO對照組相比。Fig. 2 Effects of 2.5～200 μmol·L-1 tetrabromobisphenol A (TBBPA) on the proliferation of the L02 cell after 24, 48 and 72 h exposureNote: All data were expressed as mean±S.E.M, n=6; D represents DMSO solvent control; *P<0.05, **P<0.01, compared with DMSO control.

2.3 TBBPA對細胞內氧化應激的影響

在本實驗中，通過熒光探針DCFH-DA檢測L02細胞內的ROS水平，結果如圖3所示，圖3中流式圖的橫軸表示DCF的熒光強度，反映細胞內ROS濃度，縱軸表示對應細胞的數量。用TBBPA處理L02細胞12 h引起胞內ROS濃度呈劑量依賴性增加。如圖4所示，5、10、20和40 μmol·L-1TBBPA處理組的胞內ROS濃度與DMSO對照組細胞相比，分別增加至DMSO對照組的1.26倍、1.63倍、2.51倍和3.07倍。5 μmol·L-1TBBPA暴露組中ROS含量與DMSO對照組之間沒有顯著性差異。20 μmol·L-1和40 μmol·L-1TBBPA暴露組中ROS含量與DMSO對照組比較差異性顯著(P<0.05)。隨著TBBPA劑量的增加，ROS的產量增加。高劑量的TBBPA可刺激L02細胞中產生大量的ROS，并使細胞中發生氧化應激。

圖3 流式細胞術分析L02細胞活性氧(ROS)水平Fig. 3 Analysis of reactive oxygen species (ROS) levels in L02 cells by flow cytometry

圖4 TBBPA對L02細胞內的ROS水平的影響注：數據表示為平均值±標準誤差，n=6；*P<0.05、**P<0.01，與DMSO對照組相比。Fig. 4 Effects of TBBPA on cellular ROS level in L02 cellsNote: All data were expressed as mean±S.E.M, n=6; *P<0.05, **P<0.01, compared with DMSO control.

如表1所示，TBBPA導致MDA含量顯著增加。與DMSO對照組相比，20 μmol·L-1和40 μmol·L-1TBBPA暴露組的MDA含量增加至對照的約2.6倍和3.3倍(P<0.05)。實驗結果表明，TBBPA可增加L02細胞內MDA含量，導致細胞處于氧化應激狀態。如表1所示，TBBPA引起胞內抗氧化物質GSH含量降低。與DMSO對照組相比，20 μmol·L-1和40 μmol·L-1TBBPA暴露組的GSH含量降低至DMSO對照組的0.38%和0.29%(P<0.05)。這表明，TBBPA可導致L02細胞內GSH含量降低；TBBPA導致GSSG水平顯著升高。與DMSO對照組相比，20 μmol·L-1和40 μmol·L-1TBBPA暴露組的GSSG含量升高為DMSO對照組的1.89倍和2.18倍(P<0.05)。這表明，TBBPA可導致L02細胞中抗氧化能力降低。

表1 L02細胞內丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSH)的含量Table 1 Contents of malondialdehyde (MDA), reduced glutathione (GSH) and oxidized glutathione (GSSH) in L02 cells

2.4 TBBPA對DNA損傷的影響

DNA主要存在于細胞核的染色質中，作為基因的載體，是貯存全部遺傳信息的分子[17]。選取了彗星頭部和尾部DNA分布的相對含量作為參考指標來評價分析DNA損傷程度，經5、10、20和40 μmol·L-1TBBPA處理后，彗星頭部DNA分布的相對含量分別為91.8%±0.25%、89.7%±0.43%、82.6%±1.09%和69.4%±3.37%(圖5和圖6)。尾部DNA分布的相對含量分別為8.2%±0.25%、10.3%±0.43%、17.4%±1.09%和30.6%±3.37%(圖5和圖6)。隨著TBBPA濃度的增加，彗星頭部DNA含量明顯降低，尾部DNA含量增加。40 μmol·L-1TBBPA處理組細胞尾部DNA的相對量是DMSO對照組的6.5倍。這表明，隨著TBBPA濃度的增加，拖尾現象愈加明顯，DNA損傷程度逐漸增強。

圖5 彗星實驗的熒光照片(200×)Fig. 5 Photographs of Comet assay by fluorescence microscopy (200×)

圖6 細胞頭部和尾部DNA相對含量注：數據表示為平均值±標準誤差，n=6；*P<0.05、**P<0.01，與DMSO對照組相比。Fig. 6 Relative content of DNA in the head and tail of cellsNote: All data were expressed as mean±S.E.M, n=6; *P<0.05, **P<0.01, compared with DMSO control.

2.5 TBBPA對細胞凋亡的影響

流式細胞術通過Annexin V/PI染色考察了TBBPA對L02細胞凋亡的影響。圖7中流式圖橫軸表示膜聯蛋白V(Annexin V)的綠色熒光強度，縱軸表示PI的紅色熒光強度。Annexin V陽性且PI陰性表示是早期凋亡細胞，Annexin V陽性且PI陽性表示是晚期凋亡細胞。流式檢測結果顯示，TBBPA可以濃度依賴性地誘導L02細胞凋亡(P<0.05)(圖8)，L02細胞分別經5、10、20和40 μmol·L-1TBBPA處理48 h后細胞凋亡率分別為12.63%、15.11%、30.69%和42.88%。在處理組、空白對照組和DMSO對照組之間觀察到統計學顯著性(P<0.05)。如圖8所示，細胞凋亡率隨著TBBPA濃度的增加而增加，與DMSO對照組相比，20 μmol·L-1和40 μmol·L-1TBBPA處理組細胞凋亡率分別增加了3.2倍和4.8倍，誘導L02細胞的凋亡的效果明顯。

圖7 流式細胞術檢測細胞凋亡Fig. 7 Representative graphs of cell apoptosis obtained from flow cytometry analysis

圖8 TBBPA對L02細胞凋亡率的影響注：數據表示為平均值±標準誤差，n=6；*P<0.05、**P<0.01，與DMSO對照組相比。Fig. 8 Effect of TBBPA on the apoptosis rate of L02 cellsNote: All data were expressed as mean±S.E.M, n=6; *P<0.05, **P<0.01, compared with DMSO control.

3 討論(Discussion)

肝臟是人體主要的代謝和解毒器官，可以促進多種酶的合成，對進入體內的外源毒性物質進行清除。環境中的TBBPA可通過多種途徑進入人體后，在肝臟中積累，增加肝臟的代謝負擔并對人體肝臟造成損傷。本研究的結果顯示，TBBPA抑制L02細胞增殖，與對照組比較，隨著TBBPA濃度的增加，L02細胞數量明顯減少，死亡細胞數量增多。細胞形態改變，細胞體積變小，突觸變短，甚至消失；貼壁細胞減少，與周圍的細胞脫離。MTT實驗結果顯示，TBBPA能不同程度地降低L02細胞的活性，對L02細胞有致毒性，TBBPA可以濃度依賴性地誘導L02細胞凋亡。Tada等[18]的研究表明，TBBPA處理組小鼠的肝細胞凋亡率明顯高于對照組。Nakagawa等[19]研究了TBBPA對原代大鼠肝細胞毒性，發現TBBPA可以誘導細胞凋亡進而造成肝功能損傷。

TBBPA暴露可誘導大鼠小腦顆粒細胞[20]和大鼠胰腺細胞凋亡[21]。Grasselli等[22]發現TBBPA會影響田鼠肝癌細胞的基因表達異常和細胞凋亡；Wikoff和Birnbaum[23]認為是TBBPA通過誘導細胞內產生氧化應激造成細胞凋亡對肝臟產生毒性作用，研究氧化應激機制對于研究的細胞凋亡調控具有非常重要的理論意義。向明燈等[24]結果顯示，隨著TBBPA處理濃度增加，HepG2細胞存活率下降，凋亡率增加。以上結果均說明TBBPA對肝細胞有毒性效應。

肝細胞代謝時會產生ROS[25]。在正常的生理條件下，細胞內產生和消除的ROS處于平衡狀態，以維持細胞的氧化還原穩定。當細胞受到外界環境刺激時ROS會過量產生，引起細胞內ROS的積累[26]。脂質過氧化反應是細胞內氧化損傷的一個重要指標，MDA是脂質過氧化反應的代謝產物，其含量可以間接反映細胞內氧化損傷的程度，如果細胞內MDA含量增加，則表明細胞ROS過多而造成氧化攻擊[27]。TBBPA可以引起L02細胞中MDA含量增加，細胞處于氧化應激狀態。當細胞處于氧化應激狀態時，細胞內氧化還原狀態不平衡，細胞自發產生抗氧化酶以維持氧化還原平衡。GSH是體內的重要的抗氧化劑，負責去除多余的ROS。GSSG為GSH的氧化形式，在氧化劑作用下GSH通過谷胱甘肽過氧化物酶被氧化成GSSG，調節細胞內氧化還原平衡狀態[28]。GSSG/GSH是體內主要的內源性氧化還原調節劑。細胞內GSH水平與細胞凋亡密切相關，過度消耗GSH可引發細胞凋亡[29]。在正常生理條件下，GSSG/GSH的比例保持在一定水平，而在氧化應激下，GSH被氧化成GSSG，導致GSSG/GSH比率上升。因此，GSSG/GSH可用于評估細胞內氧化應激水平。本研究結果顯示，隨著TBBPA濃度的增加，GSSG/GSH比率也顯著增加。這表明，細胞內氧化還原穩態偏移至氧化態。

細胞內ROS大量積累而使細胞處于氧化應激狀態，對細胞中的DNA分子造成不同程度的氧化損傷，誘導肝細胞凋亡，對肝臟造成損傷[30]。據相關文獻報道，細胞內源性產生和清除的ROS之間的不平衡導致ROS持續升高，可直接或間接造成DNA損傷，導致基因突變，激活細胞敏感信號通路[31]。Zhao等[32]的研究表明，阻燃劑暴露誘導細胞過量產生ROS，引起氧化應激和炎癥反應，進而誘導細胞損傷。在本研究中，筆者發現40 μmol·L-1TBBPA處理組的胞內ROS含量顯著增加，MDA和GSSG/GSH明顯高于對照組和低劑量組，說明細胞處于氧化應激狀態，40 μmol·L-1TBBPA處理后細胞尾部DNA相對含量增加至DMSO對照的6.5倍，細胞凋亡率比DMSO對照組增加了4.8倍。DNA損傷程度和L02細胞凋亡水平比對照組都有顯著增強，這些結果表明氧化應激對DNA損傷和細胞凋亡有重要作用。

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