補腎健骨方含藥血清對ROBs和rBMSCs增殖、分化和礦化的影響

周湘琳 王冬含 施根根 趙良功 封士蘭*

1.蘭州大學藥學院，甘肅 蘭州 730000

2.蘭州大學第二醫院，甘肅 蘭州 730000

骨質疏松癥是一種由多種原因引發的骨骼退化性疾病，以骨微觀結構退化、骨脆性增加為特色[1]。該病在西醫治療方面主要用藥有鈣劑、雌激素、降鈣素、氟制劑等，均具有很大的不良反應或療效不顯著等問題[2]。隨著研究不斷地深入，在治療骨質疏松方面中醫藥展現出一定的臨床價值，并且能夠有效避免西藥所產生的一系列不良反應[3]。補腎健骨方是由從事中藥及骨質疏松研究的權威專家擬得的經驗方，在長期臨床實踐中發現具有療效確定、安全性好的特點。筆者前期的研究結果表明[4]，補腎健骨方能顯著提高骨質疏松模型大鼠的骨密度，增強骨質疏松大鼠的骨斷裂點的最大載荷和彈性模量。因此本實驗以大鼠顱骨成骨細胞和骨髓間充質干細胞為研究對象，檢測補腎健骨方對其增殖和成骨分化、礦化的影響，從細胞水平探討補腎健骨方治療骨質疏松癥的作用機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：3月齡 SD 雌性大鼠，體質量180～220 g；2月齡 SD 雄性大鼠，體質量 120～170 g；出生48 h 以內SD 大鼠乳鼠，體質量 25～30 g；動物許可證號 SCXK(甘)2013-0002，均由蘭州大學實驗動物中心提供。

1.1.2試劑：胎牛血清(上海翊圣生物科技有限公司，批號：20190502)；DMEM 高糖培養基(批號：B4296)、DMEM/F12(批號：B5172)培養基均購自Hyclone公司；地塞米松(批號：A5903-16)、抗壞血酸(批號：A3033-27)、β-甘油磷酸鈉(批號：A5719-52)均購自索萊寶公司；ALP 試劑盒(批號：20180614)購自南京建成生物工程研究所；CD45、CD29、CD44 抗體(賽默飛世爾科技中國有限公司，批號：4226388，1937542，1974258)兔抗小鼠Ⅰ型膠原和山羊抗兔IgG-cy3抗體(武漢博斯特生物工程有限公司，批號：D397，B332)。

1.1.3儀器：Vaioskan Flash 多功能酶標儀(美國賽默飛世爾公司)；Attune Nxt 流式細胞儀(賽默飛世爾科技中國有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1大鼠實驗分組及補腎健骨方含藥血清的制備[5]：3月齡雌性SD大鼠30只，隨機分成無藥血清對照組、補腎健骨方含藥血清組、陽性藥含藥血清組，每組10只。補腎健骨方依據處方量(紅芪∶熟地∶女貞子∶枸杞∶懷牛膝=2∶1∶1∶1∶1)稱取藥材，用10倍量的水煎煮3次，前兩次每次1.5 h，第3次1 h，合并3次濾液濃縮至浸膏。陽性藥對照組給予戊酸雌二醇，以0.2 mg/(kg·d)的劑量每日灌胃。補腎健骨方給藥劑量按照體表面積的方法折算人體等效計量，以9 g/kg生藥計算用藥量，連續灌胃 7 d，每日灌胃 2 次，于末次給藥后2 h，經眼眶靜脈叢采血。所得血液靜置1 h 后，3 000 r/min離心10 min，分離上層血清。為了減輕大鼠的個體差異，同組動物血清合并。56 ℃ 水浴 30 min滅活補體，0.22 μm微孔濾膜除菌，分裝，-20 ℃儲存備用。傳統誘導組給予細胞的藥物為普通胎牛血清。

1.2.2ROBs細胞的分離培養與鑒定[6]：10只SD大鼠乳鼠，無菌分離顱骨。PBS漂洗顱骨2遍，用剪刀將其剪碎為1～2 mm3。將含有碎骨片的培養瓶中加入0.25%胰蛋白酶2 mL，恒溫震蕩10 min于37 ℃水浴鍋中，棄去消化液，共重復2次。加入1 mg/mL Ⅱ型膠原酶2 mL，恒溫震蕩消化15 min于37 ℃水浴鍋中，共重復6次，合并最后4次的上清液。將上清液通過200目細胞篩過濾并加入含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養基，吹打均勻。利用免疫組織化學技術對分離的成骨細胞進行鑒定。

1.2.3rBMSCs分離培養與鑒定：5只Wistar雄性大鼠被脫頸處死，無菌環境中剔出股骨和脛骨，兩端骨骺被剪去，用針頭從一側切口向髓腔內滴注DMEM/F12培養液，當骨髓腔變為透明則為沖洗干凈，合并沖出液，反復吹打以致細胞團塊被打散[7]。200目的濾網反復過濾用來得到單細胞懸液，細胞密度調整至1.0×107個/mL。選取rBMSC細胞表面標志物CD29、CD44、CD45進行流式細胞儀分析，對rBMSC進行鑒定。

1.2.4細胞增殖實驗：細胞以1×104細胞/孔接種于96孔板中。12 h后更換含不同濃度含藥血清(5%、10%、15%、20%、25%)、空白對照大鼠血清以及陽性對照含藥血清、胎牛血清的培養液，繼續培養24、48、72 h，棄培養液，PBS洗2次。利用MTT法測試ROBs和rBMSCs增殖率。增殖率=A加藥/A對照。

1.2.5細胞分化實驗：24孔板中接種原代細胞，當細胞長至90%后，普通培養基更換為誘導成骨培養基(含有抗壞血酸50 mg/L，地塞米松 1×10-8mol/L和10 mmol/L β-甘油磷酸鈉)[8]，藥物分組同上，誘導培養3、6、9 d后采用ALP試劑盒測定兩種細胞的ALP活力。

1.2.6細胞礦化實驗：12孔板中接種原代細胞，細胞長滿后給予成骨培養基誘導，成骨性誘導分化 14 d后進行茜素紅染色。拍照記錄結果，Image-Pro Plus 6.0 軟件處理圖片。

2 結果

2.1 補腎健骨方含藥血清對ROBs的作用

2.1.1ROBs的鑒定：ALP染色結果表明，成骨細胞經誘導的細胞質中存在淺棕色堿性磷酸酶顆粒，如圖1A所示。茜素紅染色顯示，該細胞經成骨誘導后會產生橘紅色或橙紅色的礦化結節，如圖1B所示。I型膠原免疫熒光染色結果表明，紅色熒光存在于細胞質，細胞核為藍色熒光，如圖1C、1D所示。

圖1 ROBs ALP、鈣化結節、I型膠原免疫熒光染色(×300)Fig.1 Immunofluorescence staining was used to detect ALP, calcified nodules, and type I collagen(×300)

2.1.2補腎健骨方含藥血清對ROBs增殖的影響：從圖2可以看出，給藥24、48、72 h后，不同濃度含藥血清對ROBs 均沒有細胞毒性作用，且隨著含藥血清濃度的增加，ROBs的增殖率也在逐漸增加。尤其當含藥血清濃度為20%時，補腎健骨含藥血清極大地促進了ROBs的增殖。但是當濃度增加到25%時，ROBs的增殖率表現出一個下降的趨勢。

圖2 不同濃度補腎健骨含藥血清對ROBs增殖的影響Fig.2 Effect of different concentrations of nourishing kidney and strong bone recipe-containing serum on the proliferation of ROBs n=6)

2.1.3補腎健骨方含藥血清對ROBs ALP活性的影響：成骨細胞表型分化包括兩個階段，即骨形成過程的早期階段和后期階段。分化的早期特征包括ALP和膠原蛋白的相對表達。從圖3中可以看出，給藥3、6、9 d后，各濃度含藥血清均能夠提高ROBs ALP 活性，并顯著高于無藥血清組和傳統誘導組(P<0.05)，其最佳濃度為20%。

圖3 不同濃度補腎健骨含藥血清對ROBs ALP活性的影響Fig.3 Effect of different concentrations of nourishing kidney and strong bone recipe-containing serum on ALP activity of ROBs

2.1.4補腎健骨方含藥血清對ROBs鈣化結節形成的影響：細胞內所含鈣鹽能夠被茜素紅所識別，給藥后ROBs產生的鈣化結節的數量和面積均極顯著高于無藥血清組和傳統誘導組，20%的濃度對ROBs的鈣化結節形成促進作用最強。見圖4。

圖4 不同濃度補腎健骨含藥血清對ROBs鈣化結節形成的影響Fig.4 Effect of different concentrations of nourishing kidney and strong bone recipe-containing serum on calcified nodules activity of ROBs

2.2 補腎健骨方含藥血清對rBMSCs的作用

2.2.1rBMSCs的鑒定：流式細胞儀結果顯示，rBMSCs經培養后能夠均一表達CD29、CD44，陽性率分別為99.52%、99.31%；而CD45的陽性率為0.113%。見圖5。

圖5 rBMSCs表面標志物CD29、CD44、CD45的表達Fig.5 Expression of surface markers CD29, CD44, and CD45 in rBMSCs

2.2.2補腎健骨方含藥血清對rBMSCs增殖的影響：給藥 24、48、72 h后，不同濃度的補腎健骨含藥血清對rBMSCs沒有細胞毒性作用。補腎健骨含藥血清濃度在10%時促進rBMSCs的增殖效果是最顯著的。濃度繼續增加，增殖率呈現出下降趨勢，說明對于rBMSCs，10%含藥血清為最佳給藥濃度。見圖6。

圖6 不同濃度補腎健骨含藥血清對rBMSCs增殖的影響Fig.6 Effect of different concentrations of nourishing kidney and strong bone recipe-containing serum on the proliferation of rBMSCs

2.2.3補腎健骨方含藥血清對rBMSCs ALP活性的影響：rBMSCs經成骨性誘導3 d后，僅5%和10%含藥血清組的ALP活性顯著高于相應的無藥血清組和傳統對照組，其中10%含藥血清組的ALP活性最高。給藥6 d后，除25%含藥血清組外，其余各組的ALP活性均顯著高于相應的無藥血清組。給藥9 d后，不同濃度的含藥血清均能提高rBMSCs ALP活性，并顯著高于無藥血清組和傳統誘導組，其中以10%含藥血清為最佳濃度。見圖7。

圖7 不同濃度補腎健骨含藥血清對rBMSCs ALP活性的影響Fig.7 Effect of different concentrations of nourishing kidney and strong bone recipe-containing serum on ALP activity of rBMSCs

2.2.4補腎健骨方含藥血清對rBMSCs鈣化結節形成的影響：給藥14 d后的鈣化結節染色結果與ALP活性檢測結果具有相似的趨勢。rBMSCs被不同濃度含藥血清作用后，其產生的鈣化結節的數量和面積均極顯著高于無藥血清組和傳統誘導組，10%含藥血清組對rBMSCs的鈣化結節形成促進作用最強。見圖8。

圖8 不同濃度補腎健骨含藥血清對rBMSCs鈣化結節形成的影響Fig.8 Effect of different concentrations of nourishing kidney and strong bone recipe-containing serum on calcified nodules activity of rBMSCs

3 討論

中醫將絕經后骨質疏松癥主要病因歸屬于骨痿、腰痛、骨痹等證[9]。補腎健骨方是由長期從事中藥及骨質疏松研究的權威專家基于中醫理論擬得的經驗方，由紅芪、熟地、女貞子、枸杞、懷牛膝組成，具有滋補肝腎、補腎壯骨、益精填髓之功效，標本兼顧[10]，能有效緩解骨質疏松癥狀，已在臨床上被廣泛應用。

實驗結果顯示，20%的補腎健骨方含藥血清更利于ROBs的生長增殖、分化礦化，10%的補腎健骨方含藥血清最利于rBMSCs生長增殖、分化礦化。本研究證實了補腎健骨含藥血清在體外能促進ROBs和rBMSCs的增殖、骨形成和礦化能力。

王艷等[11]發現牛膝通過降低尿羥脯氨酸/肌酐值含量來改善大鼠骨密度及骨生物力學性能。枸杞多糖含藥血清通過激活β-catenin和Wnt10b等Wnt信號通路來改善BMSCs的成骨活性和礦化能力[12]。女貞子水提物能減少去卵巢誘發的大鼠股骨骨小梁形態破壞和BMD的降低[13]。林日陽等[14]發現熟地鱉甲含藥血清可以通過提高成骨細胞增殖、ALP含量及cbfa1 mRNA的表達。陳宇等[15]發現紅芪抗骨質疏松作用與其所含各種成分共同作用相關。因此，推測補腎健骨方含藥血清對ROBs和rBMSCs的增殖、骨形成和礦化促進作用，與其單味藥材治療骨質疏松的作用有關。

總而言之，不同濃度的補腎健骨方含藥血清對ROBs和rBMSCs的增殖、骨形成和礦化均具有一定的促進作用，其原因可能為此方劑在促進成骨細胞增殖的同時還能促進破骨細胞的凋亡，從而達到對骨質疏松進行治療的目的。但本研究的藥理作用為動物細胞體外培養實驗的直接結果，關于補腎健骨方含藥血清進一步作用于人體的效果還需深入探討。