新疆絕經后2型糖尿病女性SOST蛋白表達及基因rs851056、rs1230399位點多態性與骨代謝關系的研究

任艷霞 李軍* 李思源 李佳佳 趙會榮 王雙

1.石河子大學附屬醫院內分泌代謝科，新疆 石河子 832000

2.石河子大學醫學院，新疆 石河子 832000

3.南陽市第二人民醫院內分泌代謝科，河南 南陽 473000

4.上海市楊浦區中心醫院，上海 200082

2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)是一種慢性全身性代謝性疾病。T2DM患者并發骨質疏松癥(osteoporosis，OP)的發病率約可達30%～60%[1]。OP是一種以骨微結構受損、骨密度(bone mineral density, BMD)減低、骨折風險增加為特征的疾病[2-3]。老年絕經后婦女由于體內雌激素水平下降，OP發生率更是達到了相同年齡段男性的3倍[4]。60%～80%的骨密度變異性是由遺傳因素決定的[4]。血清硬化蛋白(sclerostin，SOST蛋白)由SOST基因編碼產生，目前已證實SOST可抑制成骨細胞礦化，促進前成骨細胞增殖分化，負性調控骨形成，影響骨密度[6],參與骨代謝。目前已有SOST基因rs851056位點基因多態性與絕經后女性骨代謝關系的研究[7]，然而有關絕經后T2DM女性中，SOST蛋白表達及基因rs851056、rs1230399位點多態性與骨代謝關系的研究鮮有報道。本研究旨在檢測新疆地區絕經后T2DM女性SOST蛋白表達，探討SOST蛋白基因rs851065、rs1230399位點多態性骨代謝的關系，篩選OP篩查、早期診斷和治療的潛在候選基因位點，為OP患者的臨床個體化治療提供理論依據。

1 材料和方法

1.1 一般資料

選取2018年10月至 2019年10月石河子大學第一附屬醫院收治的絕經后T2DM患者，根據納入和排除標準，共選取136例研究對象。根據OGTT分為兩組，分別為糖耐量正常組(NGT組)及2型糖尿病組(T2DM組)，再結合BMD結果將以上兩組分為四組：A組(NGT合并骨量正常)；B組(T2DM合并骨量正常)；C組(NGT合并骨量異常)；D組(T2DM合并骨量異常)。下文以A(-/-)、B(+/-)、C(-/+)、D(+/+)來代表各組(-為NGT或骨量正常；+為T2DM或OP)。納入標準：清醒狀態、意識正常的絕經后女性。T2DM及OP的診斷標準分別參照1999年和1994年WHO制定的診斷標準[7-8]，即滿足：①FPG≥7.0 mmol/L或具有糖尿病癥狀加隨機血糖≥11.1 mmol/L或OGTT 2 h血糖≥11.1 mmol/L；②T值≤-2.5 SD 為OP，-2.5 SD

1.2 方法

1.2.1臨床資料的收集：收集患者年齡、絕經年限，身高、體重、腰圍及臀圍基本資料。同時計算腰臀比(WHR)、體質量指數(body mass index, BMI)。運用全自動生化儀測定受試者糖、脂、骨代謝指標：空腹血糖(FPG)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)、血鈣(Ca)、血磷(P)、堿性磷酸酶(ALP)。

1.2.2測定骨密度：通過雙能X線(DEXA)骨密度儀測定受試者腰椎(L1～4)和股骨頸骨密度水平。

1.2.3提取基因組DNA：清晨空腹狀態下抽取受試者靜脈血2 mL,抗凝后用使用DNA提取試劑盒提取DNA。

1.2.4基因組測序：行PCR擴增反應后，采用Mass ARRAY質譜儀測定SOST基因rs851065、rs1230399位點基因多態性。

1.2.5SOST蛋白測定：通過酶聯免疫吸附法(ELISA法)測定受試者血清中SOST蛋白的表達水平。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 組間基線指標的比較

C(-/+)、D(+/+)組分別與對照組A(-/-)相比，年齡、絕經年限比較差異有統計學意義(P<0.05)，后續各生化指標分析采用協方差分析排除以上影響因素，見表1。

表 1 組間基線指標的比較Table 1 Comparison of baseline indicators among groups

2.2 組間各生化指標的比較

協方差分析結果顯示，與對照組A(-/-)組相比，B(+/-)、D(+/+)兩組FPG、HbA1c均升高，差異有統計學意義(P<0.01)；C(-/+)、D(+/+)兩組TG、股骨頸BMD、L1～4BMD均下降，差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表 2 協方差分析后組間各生化指標的比較Table 2 Comparison of biochemical indicators among groups by covariance

2.3 SOST基因位點基因型及等位基因分布頻率

經檢驗，兩位點的基因型頻率均符合Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。在SOST基因rs1230399位點差異未發現有統計學意義(P>0.05)；在SOST基因 rs851056位點中，B(+/-)組、D(+/+)組與A(-/-)組相比，SOST基因 rs851056位點的基因型和等位基因頻率比較差異具有統計學意義(P<0.01)。見表3。

表3 SOST基因rs851056位點基因型及等位基因分布頻率[n(%)]Table 3 Four groups of SOST gene rs851056 locus genotype and allele distribution frequency[n(%)]

2.4 各組SOST基因rs851056位點不同基因型間生化指標及BMD的比較

C(-/+)組中，GG型HDL、Ca、ALP均低于GC/CC型，比較差異有統計學意義(P<0.05)；D(+/+)組中，GG型BMD(L1～4)高于GC/CC型，比較差異有統計學意義(P<0.05)，見表4。

表4 各組SOST基因rs851056位點基因型間生化指標及BMD的比較Table 4 Comparison of biochemical indexes and BMD among genotypes of SOST gene rs851056 in each

2.5 SOST蛋白表達比較

2.5.1SOST蛋白各組間的結果比較:與對照組A(-/-)相比，C(-/+)、D(+/+)組SOST蛋白表達水平升高，比較差異有統計學意義(P<0.01),見表5。

表5 四組SOST蛋白表達水平Table 5 The expression level of SOST protein in the four groups

2.5.2SOST蛋白水平與BMD的相關性分析：對全部受試者進行相關性研究，發現SOST蛋白水平與BMD(L1～4)有弱相關性，呈負相關(P<0.05)，見表6。

表6 SOST蛋白水平與BMD相關性分析Table 6 Correlation analysis of SOST protein and BMD

2.6 BMD與各指標的多元線性回歸分析

在D(+/+)組，分別以L1～4BMD及股骨頸BMD作為應變量，以BMI(X1)、FPG(X2)、HbA1c(X3)、基因型(X4)、WHR(X5)、年齡(X6)、絕經年限(X7)、LDL(X8)、HDL(X9)、TG(X10)、ALP(X11)、BMD與SOST基因多態性的多元逐步回歸分析結果顯示，BMI、TG的降低以及rs851056位點的突變是引起L1～4BMD降低的危險因素；BMI的降低、ALP的增加以及絕經年限的增加是引起股骨頸BMD降低的危險因素，見表7。

表7 多元逐步回歸分析BMD的影響因素Table 7 Multiple linear regression analysis of BMD influencing factors

P(X12)、Ca(X13)、SOST蛋白(X14)為自變量，進行多元線性回歸分析。

3 討論

OP的高發病率、高骨折率嚴重影響患者生活質量[10]，絕經后女性體內雌激素減少，更是OP的高發人群[11-12]。目前有關T2DM對BMD影響的研究結論不一致，有研究[13-14]表明，T2DM患者骨脆性明顯增加，骨質疏松的發病率也顯著增加[15-16]。但也有研究[17-18]表明，T2DM患者有較高或正常的骨密度。T2DM患者并發OP受環境、遺傳等多因素影響。Wnt經典信號通路是參與調節骨代謝的重要通路[19]。SOST蛋白可拮抗經典Wnt通路，影響骨代謝，降低骨密度[20-21]。關于SOST基因多態性及突變分別與2型糖尿病或骨質疏松的研究在國內外已有報道，但是關于SOST蛋白表達及其基因多態性及突變與絕經后2型糖尿病女性合并骨質疏松的研究卻鮮有報道。

本研究發現，SOST基因rs851056、rs1230399兩位點基因型及等位基因頻率均符合Hardy-Weinberg 遺傳平衡定律。Carmen[9]等研究發現，SOST基因多態性與BMD顯著相關，攜帶G等位基因患者BMD明顯降低，OP發生風險增加。澳大利亞的一項研究[22]發現，SOST基因多態性與多個部位BMD相關。本研究中，T2DM合并骨量異常組SOST基因rs851056位點基因型頻率和等位基因頻率比較有差異，提示rs851056位點基因多態性參與了骨代謝。此外，本研究還提示該位點基因突變引起了BMD的下降，多元逐步回歸結果也顯示，rs851056位點的突變是L1～4BMD降低的危險因素，提示rs851056位點的突變參與了BMD的降低。此外，筆者還發現在NGT合并骨量異常組中，CG/CC基因型患者Ca、ALP骨代謝指標均高于GG基因型患者，提示rs851056位點基因突變參與了骨代謝指標的變化，以上提示該位點多態性及其突變可能參與了絕經后T2DM女性OP的發生發展。本研究中，以rs851056位點為切點對比一般指標、骨代謝指標及骨密度指標發現，絕經后骨量異常女性中，rs851056位點等位基因的變異引起NGT合并OP(-/+)患者的Ca、APL下降，結合基線對比OP患者L1～4BMD下降，說明rs851056位點基因多態性對骨代謝產生了一定的負向影響。但該突變同時也引起T2DM合并OP(+/+)患者的L1～4BMD升高，此矛盾的結果原因可能為：①目前不能明確2型糖尿病對骨量影響是正性保護因子還是危險因素，就本研究結果而言，考慮其可能為保護因子，其與rs851056位點基因帶來的危險因子相拮抗，在本研究中表現為骨密度升高，具體理論仍需后人繼續研究；②本研究病例數少，不排除抽樣偏倚等各種混雜偏倚的產生導致結果有誤差，需要更大樣本量的前瞻性隊列研究。

SOST蛋白可抑制骨分化和骨形成，國內外有關SOST蛋白與BMD關系的研究結果不一致。Antonia等[12]研究發現SOST蛋白與T2DM患者腰椎BMD呈正相關，但Mirza等[23]對美國20例絕經后婦女調查發現，SOST蛋白與股骨頸和腰椎BMD呈負相關。本研究發現，T2DM合并骨量異常患者SOST蛋白表達水平增高，行相關分析后發現血清SOST蛋白水平與L1～4BMD呈負相關，提示高SOST蛋白是OP的危險因素。

綜上所述，新疆絕經后T2DM女性中，SOST基因rs851056位點基因多態性及基因頻率分布可能與骨、糖代謝異常有關；該位點的基因突變可能與BMD的下降及脂代謝有關；SOST蛋白表達水平與骨密度有關，是BMD降低的危險因素。因此，對于T2DM絕經后女性，可以此為靶點，為該人群OP的個體化治療提供新的理論依據。