新輔助化療對大腸腺癌組織中的CXCL6、CXCL16表達的影響及其臨床意義

王麗華 李成

大腸癌為消化系統最常見癌癥之一,為全世界第三大常見惡性腫瘤,隨著環境污染加重,人們的飲食習慣改變,生活節奏的加快等等因素的影響,大腸癌發病率不斷地提高［1］。目前傳統的手術方式已經不能滿足患者的需求,尤其對于中晚期大腸腺的患者來說,新輔助化療無疑給患者帶來希望和福音［2］。因此新輔助化療的療效檢測就顯得尤其重要。炎癥性趨化因子CXCL6 和CXCL16 可能會很好的反映出化療效果。據報道CXCL6/CXCL16 參與炎癥細胞的趨化,激發淋巴細胞、NK/T 細胞等,調節免疫應答［3］。新輔助化療后的癌組織及癌周組織微環境的改變提示新輔助化療的療效可能與CXCL6/CXCL16 有關,也預示著CXCL6/CXCL16 可能成為癌癥的免疫治療的新的靶向位點。

1 材料與方法

1.1 材料 收集本院2014～2015 年患者術前經過輔助化療、術后有完整病理的病例98 例,均為大腸腺癌中分化,Duke 分期均在Ⅲ期,患者平均年齡65.5 歲,男女比例為1.2∶1。收集2018～2019 年本院經過新輔助化療大腸腺癌新鮮標本30 例,5 例未經過新輔助化療的大腸腺癌新鮮組織作為對照組。患者平均年齡63.7 歲,男女比例為1.1∶1。所有經過新輔助化療的患者均接受術前化療(替加氟注射液1 g,q.d.；亞葉酸鈣注射液0.2 g,q.d.；注射用鹽酸昂丹司瓊8 mg,q.d.),新輔助化療治療2～3 周后行大腸癌根治切除術。

1.2 抗體及試劑 兔抗CXCL6多克隆抗體(PA5-67571,美國賽默飛公司),工作濃度1∶100。兔抗CXCL16 多克隆抗體(ab101404,Abcam 公司),工作濃度1∶200。辣根過氧化酶(HRP)標記的山羊抗兔二抗以及二氨基聯苯氨(DAB)顯色劑均購于北京中杉金橋生物技術有限公司。電化學發光(ECL)試劑盒購于上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫組織化學染色 用4%甲醛分別固定腫瘤組織和癌旁非腫瘤組織,常規脫水后進行石蠟包埋,切片,脫蠟,檸檬酸鈉溶液中進行抗原修復,分別加入稀釋后的CXCL6 一抗、CXCL16 一抗,以PBS 代替一抗作為陰性對照,4℃過夜孵育,加入稀釋后的HRP 標記的二抗,DAB 溶液顯色鏡下觀察陽性反應。染色結果進行評分。評分標準：癌細胞及癌周淋巴細胞免疫組化的評分標準用H-score 系統［4］：H-score=［1×(%cell 1+)+2×(%cell 2+)+3×(%cell 3+)］。陽性細胞百分比分級標準：得分在0～49 分為0 級,得分在50～99 分為1 級,等分在100～199 分為2 級,得分在200～300 分為3 級。其中1+為細胞漿內黃色著色；2+為細胞漿內棕黃色著色；3+為細胞漿內棕褐色,粗顆粒狀著色。陽性著色細胞數：400 倍視野下每張玻片隨機選取5 個視野,計數至少200 個細胞,觀察每個視野中陽性細胞表達率=陽性細胞計數/細胞總數×100%,并取均值。

1.3.2 Western blot 分別取約1 g 新輔助化療大腸腺癌新鮮標本及對照組織加入蛋白裂解液裂解后,以10 μg/10 μl 上樣量在到10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳；采用濕式電轉印將蛋白轉印到PVDF 膜上,轉膜條件為4℃,恒壓90 V,120 min；隨后在5%脫脂奶粉或者牛血清白蛋白(BSA)溶液中室溫封閉1 h；加入相應的一抗在4℃下孵育過夜,TBST 將膜浸洗3 次,加入二抗室溫震蕩孵育1 h；TBST 浸洗3 次,5 min/次。浸洗后將膜放于發光板上,添加ECL 發光,利用化學發光成像系統結合相關軟件檢測蛋白變化并進行數據分析。

1.3.3 患者隨訪 術后對患者進行隨訪,隨訪時間從手術后至2020年6月30日,術后2年每3個月隨訪1次,術后3～5 年每6 個月隨訪1 次,獲得患者生存情況,失訪患者納入死亡病例。

1.4 觀察指標 分析CXCL16、CXCL6 在經過新輔助化療的大腸腺癌術前術后在癌組織及癌周組織中的表達情況以及大腸癌組織中CXCL6、CXCL16 升高水平與化療反應效果的關系。

1.5 判定標準 新輔助化療后,癌組織面積可減少,該反應可用腫瘤退縮分級來表示,新輔助化療后病理評分標準：無存活癌細胞,腫瘤退縮分級為0 級(完全反應)；單個或小簇癌細胞殘留為1 級(中度反應)；殘留癌灶版間質纖維化為2 級(輕度反應)；少數或無腫瘤細胞消退,大量癌細胞殘留為3 級(反應不良)。

1.6 統計學方法 采用SPSS19.0 統計學軟件處理數據。計量資料以均數±標準差()表示,采用t 檢驗,多組組間比較使用單因素方差分析(ANOVA),P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 預后 隨訪98 例患者,失訪3 例,隨訪率96.94%(95/98),95 例隨訪患者中死亡38 例,剩余57 例患者健康或帶瘤生存,5 年總生存率為60.00%(57/95)。隨著腫瘤對新輔助化療反應性減弱,患者5 年死亡率明顯升高。見表1。

2.2 CXCL16、CXCL6 在經過新輔助化療的大腸腺癌術前術后在癌組織及癌周組織中的表達情況 免疫組化結果顯示：CXCL6 和CXCL16 在新輔助化療前在癌細胞中表達為弱陽性,二者在新輔助化療后在癌細胞及部分癌周細胞中表達為強陽性。Western Blot 結果進一步驗證了免疫組化結果,對照組腫瘤中CXCL6 和CXCL16 的水平低于新輔助化療后,見圖1a,1b。與管家基因蛋白GAPDH 相比的相對灰度值統計結果顯示,CXCL6 和CXCL16 在對照組的表達分別為(1.25±0.19)、(0.22±0.03),均低于反應中度/完全患者的(1.87±0.14)、(0.51±0.07),CXCL16 在反應不良及反應輕度患者表達(0.43±0.09)高于對照組的(0.22±0.03),差異具有統計學意義(P<0.05)。CXCL16在反應不良/輕度患者的表達低于反應中度/完全患者,差異具有統計學意義(P<0.05)。見圖1c,1d。

圖1 新輔助化療不同反應組腫瘤組織中CXCL6 及CXCL16 表達(Western Blot,GAPDH 做內參對照)。

通過對免疫組化結果對新輔助化療的大腸腺癌術前術后在癌組織及癌周組織中CXCL6 和CXCL16 的表達分析,結果顯示,術后癌組織與癌周組織中CXCL6 的0、1、2 級陽性率分別為(208±26)、(151±39)、(97±26)%均高于術前的(32±15)、(29±13)、(56±21)%,CXCL16的0、1、2 級陽性率分別為(228±36)、(198±46)、(123±21)%均高于術前的(77±27)、(86±38)、(87±32)%,差異均具有統計學意義(P<0.05)。見表1,2。同時通過單因素方差分析發現,CXCL6 在新輔助化療治療前及治療后不同反應患者之間比較,差異具有統計學意義(P<0.05)。新輔助化療治療效果越好,治療后CXCL6陽性率越高。CXCL16 在新輔助化療治療前不同反應患者中的陽性率比較,差異無統計學意義(P>0.05),而CXCL16 在新輔助化療治療后不同反應患者中的陽性率比較,差異具有統計學意義(P<0.05),即新輔助化療治療效果越好,治療后CXCL16 陽性率越高。

表1 CXCL6 在經過新輔助化療的大腸腺癌術前術后在癌組織及癌周組織中的表達情況(%,)

表1 CXCL6 在經過新輔助化療的大腸腺癌術前術后在癌組織及癌周組織中的表達情況(%,)

注：與術前比較,aP<0.05

表2 CXCL16 在經過新輔助化療的大腸腺癌術前術后在癌組織及癌周組織中的表達情況(%,)

表2 CXCL16 在經過新輔助化療的大腸腺癌術前術后在癌組織及癌周組織中的表達情況(%,)

注：與術前比較,aP<0.05

3 討論

既往研究表明,新輔助化療可縮小腫瘤體積,易于根治性手術切除,減少切緣陽性的可能；同時降低腫瘤細胞術中脫落風險,降低患者的復發率和轉移率,進而提高患者的術后生存率［5］。而作為微觀來看新輔助化療對癌組織及癌周組織的影響也是巨大的,腫瘤免疫微環境中的各組分在新輔助治療后均發生顯著性的改變,例如：瘤細胞表面與上皮間質轉化(EMT)、腫瘤干細胞(CSC)、腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)、腫瘤相關巨噬細胞(TAM),其中至關重要的是TIL,包括CD4、CD8、NKT 等免疫細胞的改變［6］,這些細胞增多可局部對癌細胞進行識別和清除,可能新輔助化療對癌組織的破壞,導致機體對癌組織的趨化排斥反應,激活免疫細胞增多也可達到地毯式搜索并殺傷撒落血液的癌細胞,遏制癌細胞的轉移［7］。

CXCL6 是一種屬于CXC 趨化因子家族的小細胞因子,也被稱為粒細胞趨化蛋白2。它通過與趨化因子受體CXC 趨化因子受體1(CXCR1)和CXC 趨化因子受體2(CXCR2)相互作用來誘導其趨化效應,從而到達調控血管生成、細胞運動性、免疫細胞浸潤、微環境中細胞生長和存活以及調節局部抗腫瘤活性的作用和腫瘤免疫反應［8］。CXCL16 是一種膜結合趨化因子,一跨膜的形式存在TM-CXCL16 和被蛋白水解酶裂解的可溶性形成SCXCL16,CXCL16 在巨噬細胞、樹突細胞、單核細胞、B 細胞以及各種癌細胞系表達［9］。在經過新輔助化療后的腫瘤微環境受到了干擾,引起風暴式的炎性反應,跟免疫炎癥有關的細胞因子也會被大量的產生。

綜上所述,新輔助化療后大腸癌組織中CXCL6、CXCL16 表達較治療前明顯升高,且與化療反應效果有關,同時由于新輔助化療效果和患者預后(5 年生存率)有明確關系,故也可將CXCL6、CXCL16 在患者腫瘤中的表達尤其是治療后的表達情況作為大腸癌患者預后的一個重要指標。